附錄

附錄1  已批準上市的微生態活菌制品

附錄2  微生態活菌制品活菌數測定法

附錄3  微生態活菌制品雜菌檢查法

使用說明

應符合“生物制品包裝規程”規定和批準的內容。

附錄1  已批準上市的微生態活菌制品

 

 

附錄2  微生態活菌制品活菌數測定法

       無菌稱取3.0g制品或菌粉（膠囊取內容物），加入27.0ml稀釋液中，充分搖勻，做10倍系列稀釋（最終根據不同的指標要求而定）。取最終稀釋度的菌液100μl，滴入選擇性瓊脂培養基平皿上，共做3個平皿，并以玻棒涂布均勻，置適宜條件下培養，到期觀察每個平皿菌落生長情況，并計數。當平皿菌落數小于10或大于300時，應調整最終稀釋度，重新測定。根據3個平皿菌落數按下列公式計算活菌數：

 

活菌數（CFU/g）=   3個平皿菌落數之和／3 ×10×最終稀釋度

                        

       【附注】（1）活菌數用“CFU”表示，即為細菌集落單位。

       （2）稀釋液使用滅菌生理氯化鈉溶液或其他適宜的稀釋液。

       （3）選擇性瓊脂培養基，是指最適宜制劑（或菌粉）中活菌生長的培養基。須經批準后方可使用。

 

附錄3   微生態活菌制品雜菌檢查法

      微生態活菌制品雜菌檢查法系檢查微生態活菌制品的菌粉、半成品及成品受外源微生物污染程度的方法。檢查項目包括控制菌檢查，非致病性雜菌、真菌計數。

       雜菌檢查應在環境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區域內進行。檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止再污染。單向流空氣區域、工作臺面及環境應定期按《醫藥工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標準進行潔凈度驗證。

      除另有規定外，本檢查法中細菌培養溫度為30～37℃；真菌培養溫度為20～28℃。

      檢驗量及供試品的準備

      檢驗量，即一次試驗所用的供試品量（g）。檢驗時，應從2個以上最小包裝單位中隨機抽取不少于3倍檢驗用量的供試品。

      菌粉、半成品以及成品為散劑和顆粒劑的可直接稱取備用；成品為片劑、膠囊劑的需研碎后備用。

      控制菌檢查

      控制菌檢查用培養基的適用性檢查

      控制菌檢查用的培養基，即成品培養基、由脫水培養基或按培養基處方配制的培養基，均應進行培養基的適用性檢查。檢查項目包括促生長、指示和抑制特性能力。

      菌種  試驗所用的菌株傳代次數不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。

      大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]

      金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]

      乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）[CMCC(B)50094]

      銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104]

      生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(B)64941]

      白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98001]

      痢疾志賀菌（Shigella dysenteriae）[CMCC(B)51252]

      菌液制備  接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基或營養瓊脂培養基中，接種生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，培養18～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基或改良馬丁瓊脂培養基中，培養24～48小時。用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數為10～100CFU或100～1000CFU的菌懸液。

       菌懸液制備后應在2小時內使用，若保存在2～8℃的菌懸液可以在24小時內使用。

 

      適用性檢查   控制菌檢查用培養基的適用性檢查所用的菌株及檢驗項目見表1。

 

表1  控制菌檢驗用培養基的促生長、抑制和指標能力檢查

 

       （1）增菌培養基促生長能力檢查  分別接種不超過100CFU的試驗菌于被檢培養基和對照培養基中，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及最短培養時間下培養。與對照培養基比較，被檢培養基試驗菌應生長良好。

       （2）固體培養基促生長能力檢查  取試驗菌各0.1ml（含菌數50～100CFU）分別涂布于被檢培養基和對照培養基平皿中，每種培養基平行制備2個平皿，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及最短培養時間下培養。被檢培養基與對照培養基相比，生長的菌落大小、形態特征應一致。

       （3）培養基抑制能力檢查   接種不小于100CFU的試驗菌于被檢培養基中，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及最長時間下培養，試驗菌應不得生長。

       （4）培養基指示能力檢查   分別接種不超過100CFU的試驗菌于被檢培養基和對照培養基平皿上，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及時間下培養。被檢培養基中試驗菌生長的菌落形態、大小、指示劑反應情況等應與對照培養基一致。

       

        供試品檢查

        供試品的控制菌檢查應按下述方法進行。

        陽性對照試驗  供試品進行控制菌檢查時，應做陽性對照試驗。取陽性對照菌于相應選擇培養基平皿上劃線接種，按供試品的控制菌檢查方法培養，觀察菌落生長情況。陽性對照試驗應檢出相應的控制菌。

       陰性對照試驗   取增菌液0.1ml，照相應控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。陰性對照應無菌生長。

      1.    大腸埃希菌（Escherichia coli）

      （1）增菌培養  稱取供試品1g，加到9ml滅菌膽鹽乳糖培養基中，培養18～24小時。

      （2）特異培養  將上述增菌液搖勻，取0.1ml滴加到曙紅亞甲藍瓊脂平皿上，以玻棒涂勻，一式3份，培養18～24小時，觀察菌落生長情況。

      （3）結果判定  陽性對照平皿應長出紫黑色、圓形、稍凸起、邊緣整齊、表面光滑、帶有金屬光澤的菌落。

供試品平皿上若未見菌落生長或生長的菌落與陽性對照的菌落形態特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌；若生長的菌落與陽性對照的菌落形態特征相符貨疑似，應做革蘭氏染色鏡檢等適宜的鑒定試驗，鑒別是否為制品中的目的菌或大腸埃希菌。

       2.志賀菌（Shigella）、沙門菌（Salmonella）

      （1）增菌培養  稱取供試品1g，加到9ml滅菌膽鹽乳糖培養基中，培養18～24小時。

      （2）特異培養  將上述增菌液搖勻，取0.1ml滴加到沙門、志賀菌屬瓊脂平皿上，以玻棒涂勻，一式3份，培養24～48小時，觀察菌落生長情況。

      （3）結果判定  陽性沙門菌對照平皿應長出無色透明或半透明、圓形、光滑、稍隆起菌落，中心呈黑褐色。陽性志賀菌對照平皿應長出無色、半透明、圓形、微凸、光滑的菌落。

      供試品平皿培養24小時、48小時各觀察結果1次，若未見菌落生長，判供試品未檢出、沙門菌；若有菌落生長，應與陽性對照的菌落比較，并做革蘭氏染色鏡檢等適宜的鑒定試驗，鑒別是否為制品中的目的菌或志賀菌、沙門菌。

        3.銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）

      （1）增菌培養  稱取供試品1g，加到9ml的NAC液體培養基中，培養18～24小時。

      （2）特異培養  將上述增菌液搖勻，取0.1ml滴加NAC瓊脂平皿上，以玻棒涂勻，一式3份，培養24～48小時，觀察菌落生長情況。

      （3）結果判定  陽性對照平皿應長出產綠色色素的菌落，可使整個培養基呈綠色。

      如平皿上無菌落生長或生長的菌落與陽性對照菌落形態特征不符，判供試品未檢出銅綠假單胞菌；如平皿生長的菌落與上述菌落形態特征相符或疑似，應挑選2～3個菌落，分別接種于營養瓊脂培養基斜面上，培養18～24小時。取斜面培養物進行革蘭氏染色、鏡檢及氧化酶試驗，鑒別是否為制品中的目的菌或銅綠假單胞菌。

        氧化酶試驗  取潔凈濾紙片置于平皿內，用無菌玻棒取斜面培養物涂于濾紙片上，滴加新配制的1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在30秒內若培養物呈粉紅色并逐漸變為紫紅色為氧化酶試驗陽性，否則為陰性。

        若斜面培養物為非革蘭氏陰性無芽孢桿菌或氧化酶試驗陰性，均判供試品未檢出銅綠假單胞菌。否則，應進行綠膿菌素試驗。

       綠膿菌素（Pyocyanin）試驗  取斜面培養物接種于PDP瓊脂培養基斜面上，培養24小時，加三氯甲烷3～5ml只培養管中，攪碎培養基并充分振搖。靜置片刻，將三氯甲烷相移至另一試管中，加入1mol/L鹽酸試液約1ml，振搖后，靜置片刻，觀察。若鹽酸溶液呈粉紅色，為綠膿菌素試驗陽性，否則為陰性。同時用未接種的PDP瓊脂培養基斜面同法作陰性對照，陰性對照試驗應呈陰性。

       若上述疑似菌為革蘭氏陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陽性，判供試品檢出銅綠假單胞菌；若上述疑似菌為革蘭氏陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陰性，應繼續進行適宜的鑒定試驗，確認是否為銅綠假單胞菌。

       4.金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）

      （1）增菌培養  稱取供試品1g，加到9ml7.5%滅菌氯化鈉肉湯培養基中，培養18～24小時。

      （2）特異培養  將上述增菌液搖勻，取0.1ml滴加到甘露醇氯化鈉瓊脂平皿上，以玻棒涂勻，一式3份，培養24～48小時，觀察菌落生長情況。

      （3）結果判定  陽性對照平皿應長出產金黃色素的圓形、凸起、邊緣整齊的菌落。

       供試品平皿上若未見菌落生長或生長的菌落與陽性對照菌落形態不符，判未檢出金黃色葡萄球菌；若平皿上生長的菌落與陽性對照品的菌落特征相符或疑似，應挑選2～3個菌落，分別接種于營養瓊脂培養基斜面上，培養18～24小時。取營養瓊脂培養基的培養物進行革蘭氏染色，并接種于營養肉湯培養基中，培養18～24小時，做血漿凝固酶試驗。

      血漿凝固酶試驗  取滅菌小試管3支，各加入血漿和無菌水混合液（體積比1:1）0.5ml，再分別加入可以菌株的營養肉湯培養物（或由營養瓊脂培養基斜面培養物制備的濃菌懸液）0.5ml、金黃色葡萄球菌營養肉湯培養物（或營養瓊脂培養基斜面培養物制備的濃菌懸液）0.5ml.、營養肉湯或0.9%無菌氯化鈉溶液0.5ml，即為試驗管、陽性對照管和陰性對照管。將3管同時培養，3小時后開始觀察直至24小時。陰性對照管的血漿應流動自如，陽性對照管血漿應凝固，若試驗管血漿凝固者為血漿凝固酶試驗陽性，否則為陰性。如陽性對照管或陰性對照管不符合規定時，應另行制備血漿，重新試驗。

       若上述疑似菌為非革蘭氏陽性球菌、血漿凝固酶試驗陰性，亦非制品中的目的菌，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。

       5.梭菌（Clostridium）

       （1）增菌培養  取供試品1g，2份，其中1份置80℃保溫10分鐘后迅速冷卻。上述2份供試品直接或處理后分別接種至9ml的梭菌增菌培養基中，置厭氧條件下培養48小時。

       （2）特異培養  取上述每一培養物0.1ml，分別涂布接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養基平皿上，一式3份，置厭氧條件下培養48～72小時。

      （3）結果判定  陽性對照平皿應長出典型的梭菌菌落。若供試品平皿上未見菌落生長，判供試品未檢出梭菌；若供試品平皿上有菌落生長，應挑選2～3個菌落分別進行革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗。

      過氧化氫酶試驗  取上述平皿上的菌落，置潔凈玻片上，滴加3%過氧化氫試液，若菌落表面有氣泡產生，為過氧化氫酶試驗陽性，否則為陰性。

若上述可以菌落為革蘭氏陽性菌落，應對芽孢的位置、大小、形態進行觀察，并做適宜的鑒定試驗，判斷是否為梭菌。

       6.白色念珠菌（Candida albicans）

      （1）增菌培養  取供試品1g，接種至9ml的沙氏葡萄糖肉湯培養基中，培養24～48小時。

      （2）特異培養  取上述培養物0.1ml，滴加到沙氏葡萄糖瓊脂培養基平皿上，以玻棒涂勻，一式3份，培養24～48小時（必要時延長至72小時）。

      （3）結果判定  陽性對照平皿應長出乳白色偶見淡黃色的菌落，菌落表面光滑，有濃酵母氣味，培養時間稍久則菌落增大、顏色變深、質地變硬或有褶皺。若供試品平皿上未見菌落生長或生長的菌落與陽性對照菌落形態特征不符，判供試品未檢出白色念珠菌。如供試品平皿上生長的菌落與陽性對照菌落形態特征相符貨疑似，應挑選2～3個菌落分別接種至念珠菌顯色培養基平皿上，培養24～48小時（必要時延長至72小時）。若供試品平皿上無綠色或翠綠色的菌落生長，判供試品未檢出白色念珠菌。若供試品平皿上生長的菌落為綠色或翠綠色，挑取相符或疑似的菌落接種于1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養基上，培養24～48小時。取培養物進行革蘭氏染色鏡檢及芽管試驗。

       芽管試驗  挑取1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養基上的培養物，接種于加有1滴血清的載玻片上，蓋上蓋玻片，置濕潤的平皿內，于35～37℃放置1～3小時，顯微鏡下觀察，可見到由孢子長出短小芽管。

       若上述疑似菌為非革蘭氏陽性菌，顯微鏡未見厚膜孢子、假菌絲、芽管，亦非制品中的目的菌，判供試品未檢出白色念珠菌。

 

       非致病性雜菌、真菌計數

       1.計數培養基的適用性檢查

      費致病性雜菌、真菌計數用的培養基，及成品培養基、由脫水培養基或按培養基處方配制的培養基，均應進行培養基的適用性檢查。

       菌種  對試驗菌種的要求同控制菌培養基的適用性檢查。枯草芽孢桿菌活菌制品不應選擇枯草芽孢桿菌作為試驗菌株。

       大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]

       金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]

       枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]

       白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]

      菌液制備  接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基或營養瓊脂培養基中，培養18～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基或改良馬丁瓊脂培養基中，培養24～48小時。上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數為50～100CFU或500～1000CFU的菌懸液。

       菌懸液制備后應在2小時內使用，若保存在2～8℃的菌懸液可在24小時內使用。

       適用性檢查  取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液各1ml（含50～100CFU），分別注入無菌平皿中，立即傾注營養瓊脂培養基。每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置30～37℃培養48小時，計數；取白色念珠菌液1ml（含50～100CFU），注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置20～28℃培養72小時，計數。或采用涂布法，取上述菌液各0.1ml（含菌數50～100CFU），分別涂布于相應瓊脂培養基平皿上，以玻棒涂布均勻，一式2份，同法培養，計數。同時，用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述試驗。

       結果判定  被檢培養基的菌落平均數與對照培養基的菌落平均數相比大于70%，且菌落形態、大小應與對照培養基上的菌落一致，判該培養基的適用性檢查符合規定。

       2.    供試品檢查

       供試品的非致病性雜菌、真菌檢查應按下述方法進行。

      陽性對照  除另有規定外，真菌以白色念珠菌為對照，其它以金黃色葡萄球菌為對照菌。

      因供試品為活菌制品，應選用能抑制目的菌生長的選擇性培養基進行檢查。除另有規定外，營養瓊脂培養基用于非致病性雜菌的計數，玫瑰紅鈉瓊脂培養基用于真菌計數。

      （1）真菌計數  稱取供試品1g，加到9ml0.9%無菌氯化鈉溶液或其他適宜稀釋液中，混勻，做10倍系列稀釋，取適宜稀釋度供試品溶液0.1ml加到已備好的玫瑰紅鈉瓊脂培養基上，以玻棒涂勻，一式3份，倒置，于恒溫培養箱中培養96小時，每天觀察結果，記錄平皿上生長的真菌菌落數。

      結果計算：以3個平皿上生長的菌落平均數計算。

 

       真菌數（CFU/g）=  3個平皿菌落數之和／3 ×100

                                     

       （2）非致病性雜菌計數   稱取供試品1g，加到9ml0.9%無菌氯化鈉溶液或其他適宜稀釋液中，混勻，做10倍系列稀釋，取適宜稀釋度供試品溶液0.1ml加到已備好的瓊脂培養基上，以玻棒涂勻，一式3份，倒置，恒溫培養箱中培養48小時，每天觀察結果，記錄平皿上生長的菌落數。

        結果計算：方法同真菌計數。

     

       結果判定

       供試品檢查控制菌或其他致病菌時，按一次檢出結果為準，不再復試。

       供試品的非致病菌雜菌總數、真菌數，任何一項不符合規定，不再復試。

       控制菌檢查、非致病性雜菌總數、真菌數3項結果均符合規定，判供試品雜菌檢查合格；若其中任何一項不符合規定，判供試品雜菌檢查不合格。

 

       稀釋液

       除另有規定外，微生態活菌制品雜菌檢查用稀釋液采用0.9%無菌氯化鈉溶液。稀釋液配制后，應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。

       1.pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液

        照無菌檢查法（附錄XII A）制備。

        2.0.9%無菌氯化鈉溶液

       稱取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml，過濾，分裝，滅菌。

     

       培養基及其制備方法

       照無菌檢查法（附錄XII A）和微生物限度檢查法（附錄XII G）中“培養基及其制備方法”的處方制備，未收錄的培養基可按照以下配方配制，也可使用按該處方生產的符合要求的脫水培養基。配制后，應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。

      1.7.5%氯化鈉肉湯培養

        蛋白胨         10.0g

        氯化鈉         75.0g

        牛肉浸粉        3.0g

        水            1000ml

       取上述成分混合，微溫溶解，調pH值為弱堿性，煮沸，濾清，調pH值使滅菌后為7.2±0.2，分裝，滅菌。

 

      2.NAC液體培養基

      蛋白胨                    20.0g

      萘啶酮酸               0.015g

      硫酸鎂                      0.3g

      磷酸氫二鉀                0.3g

      溴化十六烷基三甲銨    0.3g

      水                       1000ml

      取上述成分，混合，微溫溶解，調pH值使滅菌后為7.5±0.1，分裝，滅菌。

 

      3.NAC瓊脂培養基

      蛋白胨                     20.0g

      萘啶酮酸                0.015g

      硫酸鎂                       0.3g

      磷酸氫二鉀                 0.3g

      瓊脂                        14.0g

      溴化十六烷基三甲銨     0.3g

      水                         1000ml

      除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調pH值使滅菌后為7.5±0.1，加入瓊脂，加熱溶脹后，分裝，滅菌，冷至60℃，傾注平皿。

      限度標準

     雜菌檢查的限度標準是基于藥品的給藥途徑和對患者健康潛在的危害以及活菌制品的特殊性而制訂的。

 

        1.口服微生態活菌制品

       （1）菌粉

      大腸埃希菌  每1g不得檢出。

      金黃色葡萄球菌  每1g不得檢出。

      銅綠假單胞菌  每1g不得檢出。

      沙門菌及志賀菌  每1g不得檢出。

      非致病性雜菌數  每1g不超過500CFU。

      真菌數  每1g不超過100CFU。

      （2）半成品、成品

      大腸埃希菌  每1g不得檢出。

      金黃色葡萄球菌  每1g不得檢出。

      銅綠假單胞菌  每1g不得檢出。

      沙門菌及志賀菌  每1g不得檢出。

      非致病性雜菌數  每1g不超過1000CFU。

      真菌數  每1g不超過100CFU。

     2.陰道微生態活菌制品

     菌粉、半成品及成品：

     金黃色葡萄球菌  每1g不得檢出。

     銅綠假單胞菌  每1g不得檢出。

     梭菌  每1g不得檢出。

     白色念珠菌  每1g不得檢出。

     真菌  每1g不得檢出。

     非致病性雜菌數  每1g不超過100CFU。