微生物學診斷

細菌學診斷

1 ．細菌的形態鑒定

細菌微小，必須借助于光學顯?微鏡才能看到。細菌從形態上可分為球狀、桿狀和螺旋狀三種基本類型。細菌細胞的基本構造是由細胞壁、胞漿膜、細胞漿、細胞核等部分構成。有的細菌除具有基本構造外，還能形成莢膜、芽胞、鞭毛、柔毛等特殊構造?。細菌的形態、大小及染色是鑒定細菌的重要標志。

( 1 ）不染色標本的制備和檢?查：不染色標本主要用于觀察活體微生物的狀態和運動性，例如壓滴標本。壓滴標本是取潔凈載玻片一張，在其上加一滴生理鹽水（如是液體材料可以不加水），再用接種環在火焰上灼燒滅菌后蘸取適量的待檢材料，然后在水滴上加蓋一張潔凈的蓋玻片（注意不可有氣泡）。檢查時將標本置于顯微鏡載物臺匕先用低倍鏡測定位置，然后用高倍鏡或油鏡觀察。

( 2 ）染色標本的制備

①抹片標?本的制作：對于固體培養物，取一滴蒸餾水或生理鹽水于清潔無塵玻片一端。左手持菌種管，右手持接種環于火焰上滅菌，右手小指與無名指夾住菌種管棉塞并取下，管口迅速通過火焰滅菌，以滅菌的接種環自??菌種管內挑少許培養物，與蒸餾水棍合，涂布成約直徑為1 厘米的涂片，涂片應薄而均勻。對于液體培養物不必加蒸餾水或生理鹽水直接以無菌操作采用液體培養物1 一2 環作涂片即可。對于組織臟器，右手持無菌??鑷子夾住一塊組織（如肝脾），左手用無菌剪刀剪取所夾組織，右手隨即以新鮮切?面在玻片的一端觸及壓印涂片。

涂片最后在室溫中令其自然干燥。冬?天氣溫較低或急用時，可將標本面向上，小心在酒精燈火焰近處略烘，加速水分蒸發，但勿緊靠火焰以免標本烤枯。

②抹片的固定：手執玻片的一端，即涂有標本的遠端，標本面向上，在火焰包層快速地來回通過三次，約3 一4 秒鐘，每次通過火焰后以手背不燙為宜。待冷后進行染色。固??定的目的是殺死細菌，使菌體蛋白凝固于玻片上，不至于染色時被水沖去，便于著色。組織觸片不宜用火固定，用化學法（如甲醇）固定。

( 3 ）染色方法

①單染色法：如亞甲藍染色法，取經干燥、固定的涂片滴加亞甲藍染液2 - 3 滴，使染液蓋滿涂片面，1-2 分鐘后吸去染色液，用細小水流沖去多余染液，晾干或用濾紙輕輕吸干。結果是菌體呈藍色，莢膜呈粉紅色。

②復染色法：如革蘭染色法，其操作步驟是取干燥并經火焰固定的涂片滴加草西酸錢結晶紫2 - 3滴于涂面上，染色1 分鐘后水洗，并將玻片L 積水輕輕拭凈。加革蘭碘溶液2- 3 滴于涂片仁媒染1分鐘后，倒去碘液輕輕拭凈，再加95 ％酒精3 一5 滴于涂面L ，頻頻搖晃水溶液（或石炭酸復紅溶液）復染30 秒，水洗后用油鏡觀察。結果是革蘭陽性菌呈紫色，革蘭陰性菌為紅色。

③女原姆薩染色法：觸片經自然干燥后，不用火焰Ib1 定，直接滴加姬姆薩染色液數滴（染液中有甲醇，能起固定作用），經2 分鐘后再加等量蒸餾水．輕輕搖晃使之與染液混合均勻。5 分鐘后水洗干燥，或將玻片浸人盛有染色液的缸中，染色數小時或過夜，取出水洗、干燥、滴油鏡檢。

④芽胞染色法：取干燥火焰固定的涂片，滴加5 ％孔雀綠水溶液于涂片上，加熱使其產生水蒸氣，以不產生氣泡為佳，約30 一60 秒，水洗30 秒，以石炭酸復紅（或沙黃水溶液）．復染30秒，水洗、吹干鏡檢。菌體呈紅色，芽胞呈綠色。

⑤鞭毛染色法：染色液有甲液（0 . 5 ％苦味酸）l 毫升、乙液( 20 ％靴酸液）l 毫升、丙液（5 ％鉀明礬液）0 . 5 毫升、丁液（11 ％復紅酒精溶液）0 . 15 毫升。各液在使用前，按順序混合好可使用。染色法是取10 一12 小時的幼齡培育菌，用1 ％福爾馬林液制成菌液，固定24小時后，于載玻片上涂成薄片。待自然干燥后，用上述染色液加溫染色30 秒至1 分鐘，然后靜置1 一2 分鐘，水洗，干燥，鏡檢。結果菌體呈深紅色，鞭毛為淡紅色。

⑥抗酸??染色法：在固定后的涂片上，滴石炭酸一品紅染色液，在載玻片下用火焰加熱至發生蒸汽但不能產生氣泡，約3 一5 分鐘后用3 ％鹽酸酒精脫色，至無紅色脫落為止（約1 一3 分鐘），再水洗后，以堿性亞甲藍染液復染1 分鐘。水洗，吸干，鏡檢。??結核桿菌和副結?核桿菌均為抗酸性細菌，故可以用此染色法和其他細菌相區別。結果是抗酸性菌染成紅色，其他菌為藍色。

⑦負染色法（墨汁襯色法）：于干凈的載玻片卜加1 滴苯胺黑（或優質繪圖墨汁），用滅菌的接種環取待檢材料（以純培養或病料）少許，均勻混合于苯胺黑（或墨汁）中，并立即將其涂散，使成薄的涂??片，待其干后不用水洗即直接鏡檢，可見在黑色的背景上，出現不著色透明菌體，所以稱負染色法。結果是螺旋體無色發亮，背景呈?黑色。

⑧雷別格爾莢膜染色法：涂片、干燥，滴加2 ％一3 ％福爾馬林龍膽紫染液，染色20 一30 分鐘，立即水洗，干燥，鏡檢。結果莢膜呈淡紫色，菌體為深紫色。

⑨螺旋體染色法（剛果紅法）：染色液是2 ％剛果紅水溶液及1 % -2 ％鹽酸酒精液，染色是在載玻片上滴加螺旋體的標本和2 ％剛果紅水溶液各1 滴，混勻，涂成薄片。干燥后滴加1 % - 2 %鹽酸酒精液，剛果紅則由紅變藍，干燥后不必再用水沖洗，鏡檢。在藍色背景下見有透亮未染色的螺旋體。

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