微生物菌體形態觀察是微生物學基本操作。菌體形態的檢查過程一般經過涂片、染色和顯微鏡檢。總體而言，微生?物染色方法一般分為單染色法和復染色法兩種。前者用一種染料使微生物染色，但不能鑒別微生物，如乳酸酚棉蘭染色液，用于真菌的染色。復染色法是用兩種或以上染料，能協助鑒別微生物。常用法有?革蘭氏染色法，還有鑒別細胞各部分結構如芽孢、鞭毛、莢膜等特殊染色法。

微生物染色方法各式各樣，本文著重介紹 

1) 革蘭氏染色法 

2) 乳酸酚棉藍染色法 

3) 芽孢染色法 

4) 鞭毛染色法 

5) 莢膜染色法。

一、革蘭氏染色法

1 操作步驟

  革蘭氏染色法，是指細菌學中廣泛使用的一種重要的鑒別染色法。不僅能觀察到細菌的形態而且還可將所有細菌區分為兩大類：染色反應呈藍紫色的稱為革蘭氏陽性細菌，用G＋表示，染色反應呈紅色（復染顏色）的稱為革蘭氏陰性細菌，用G-表示。細菌對于革蘭氏染色的不同反應，是由于它們細胞壁的成分和結構不同而造成的。革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要是由膚聚糖形成的網狀結構組成的，在染色過程中，當用乙醇處理時，由于??脫水而引起網狀結構中的孔徑變小，通透性降低，使結晶紫一碘復合物被保留在細胞內而不易??脫色，因此，呈現藍紫色；革蘭氏陰性細菌的細胞壁中膚聚糖含量低，而脂類物質含量高，當用乙醇處理時，脂類物質溶解，細胞壁的通透性增加，使結晶紫一碘復合物易被乙醇抽出而脫色，然后又被染上了復染液（番紅）的顏色，因此呈現紅色。

  一般挑選16-24h內的新鮮培養物進行。鏡檢應采用油鏡進行，放大倍數為1000倍。

 ??; 涂片：將培養的不同菌分別作涂片（注意涂片切不可過于濃厚），干燥、固定。固定時通過火焰1-2 次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。

  初染：加結晶紫液蓋滿標本處，染一分鐘后水洗，并將玻片上積水輕輕甩凈。

  媒染：加碘液蓋滿標本處，1分鐘后水洗，甩凈玻片上積水。

  脫色：加95%酒精蓋滿標本，輕輕搖動玻片，約20秒鐘后水洗、甩干。

  復染：加稀釋石炭酸復紅液或沙黃溶液1-2滴蓋滿標本，染30秒鐘后水洗，待標??本自干或用吸水紙印干。

觀察：鏡檢干燥后置油鏡觀察，革蘭氏陰性菌呈紅?色，革蘭氏陽性菌呈紫色。以分散開的細菌的革蘭氏染色反應為準，過于密集的?細菌，常常呈假陽性。

  細菌有三種基本形態，即球形、桿形和螺旋形，分別??稱為球菌、桿菌和螺形菌。具體如圖1所示：

圖1. 細菌菌體特征

1.微球菌 2.葡萄球菌 3.雙球菌 4.鏈球菌 5.四聯球菌 6.八疊球菌 7.桿菌 8.球菌 9.鏈桿菌 10.梭狀桿菌 

11.棒狀桿菌 12.芽孢桿菌 13.破傷風棱菌 14.弧菌 15.螺菌 16.莢膜 17.菌鞭毛

二、乳酸酚棉藍染色法

1 操作步驟

  染??色：于潔凈載玻片上，滴1-2滴乳酸酚棉藍染色液，用解剖針從霉菌菌落的邊緣外取少量帶有  孢子的菌絲置于染色液中，再細心地將菌絲挑散開，然后小心地蓋上蓋玻片，注意不要產生氣泡。置顯微鏡下先用低倍鏡觀察，必要時再換高倍鏡。

  觀察：染好后的標本片用顯微鏡觀察結果，酵母菌細胞、菌絲體和產孢結構等皆可被染成亮藍色；背景為?暗淡的藍色。

圖2. 乳酸酚棉藍染色實物圖

圖3 曲霉菌體形態圖

1.分生孢子 2.次生小梗 3.初生小梗 4.頂囊 5.分生孢子梗 6.足細胞

三、芽孢染色法

1 操作步驟

  一般革蘭氏染色只能把芽孢周圍的細胞質染色，不能直接把芽孢染上，故芽孢會透亮，能夠觀察到芽孢。??若不清晰可進一步采用芽孢染色法。

  染色：用接種環取菌樣涂布于玻片上，待自然干燥。而后通過火焰加熱將菌固定于玻片上。將涂片放入平皿內，片上放兩層濾紙，滴加足量的5.0%孔雀綠水溶液。將平皿蓋好，54℃-56℃?水浴加熱30min。取出，去濾紙，用純化水沖洗殘留孔雀綠溶液。加0.5% 沙黃水溶液，染1min。水洗，待干后油鏡觀察。

  觀察：染好后的標本片用顯微鏡觀察結果，芽孢呈綠色，菌體呈紅色。

圖4.芽孢染色實物圖

  許多細菌（如芽孢桿菌等）發育到某一階段，在細胞內形成一個圓形或橢圓形，抗逆性強的休眠體構造，稱為芽孢。芽孢著生的位置、形狀、大小因菌種不同而異。一般分??為中央??芽孢、末端芽孢、偏端芽孢、游離芽孢等。

圖5 細菌芽孢的各種類型

四、莢膜染色法

  莢膜(caps??ule)是某些細菌表面的特殊結構，是位于細胞壁表面的一層松散的粘液物質，莢膜的成分因不同菌種而異，主要是由葡萄糖與葡萄糖醛酸組成的聚合物。

  涂片：按?常規法涂片，可多挑些菌體與水充分混合，并將粘稠菌液盡量涂開，涂布面積不宜過大。

  干燥：在空氣中自然干燥。

  染色：用溶液A染5-7分鐘。

  脫色：用溶液B洗去結晶紫，??脫色要適度（沖洗2遍）。用吸水紙吸干，并立即加1-2滴香柏油于涂片處，以防止CuSO4結晶的形成。鏡檢。

  觀察：背景藍紫色，菌體紫色，莢膜無色或淺紫色。

圖6 莢膜細菌結構圖

五、鞭毛染色法

  長在某些細菌菌體上細長而彎曲的具有運動功能的蛋白?質附屬絲狀物，稱為鞭毛。許?多細菌都是運動的，通常使用鞭毛移向營養物質。鞭毛很薄，不易染色和觀察。

  涂片：取幼齡細菌培養物制成涂片。

  干燥：火焰干燥及固定。

  染色：鞭毛染色液2-3滴，在室溫中染色2-3分鐘。

  脫色：水洗，干燥后鏡檢（油鏡）。

  觀察：菌體和鞭毛呈紫色。

圖5 蠟樣芽孢桿菌鞭毛染色圖

圖6 細菌鞭毛著生方式

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