一、培養基用途和原理:
ONPG培養基用于各類革蘭氏陰性桿菌β-半乳糖苷酶的產生能力。也可用于鑒別遲緩發酵乳糖細菌與乳糖陰性細菌??,還可將ONPG陽性的蔥頭假單胞菌(Pseudomonas copacia)及嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonas maltophila )與其它假單胞菌?區分開。陽性菌可使培養基變黃,故不宜用于檢測黃色細菌。
該培養基的原理為,細菌分解乳糖依靠??兩種酶的作用,一種是β-半乳糖苷酶滲透酶(βeta-galactosidase permease),它位于細胞膜上,可送乳糖分子滲入細胞。另一種為β-半乳糖苷酶(βeta-galactosidase),也稱乳糖酶(Lactase),位于細胞內,能使乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。
具有上述兩種酶的細菌,能在24-48h發酵乳?糖,而缺乏此兩種酶的細菌,不能分解乳糖,乳糖遲緩發酵菌只有β-D-半乳糖苷酶(胞內酶)而缺乏β-半乳糖苷酶滲透酶,因而乳糖進入細菌細胞很慢,須經培養基中?1%乳糖較長時間的誘導,產生相當數量的滲透酶后,才能較快分解乳糖,故呈現遲緩發酵現象。
ONPG可迅速進入細菌細胞,被半??乳糖苷酶水解,釋放出黃色的鄰位硝基苯酚(O-nitrophenol,ONP),故由培養液變黃可迅??速測知β-半乳糖苷酶的存在,從而確定該菌為乳糖遲緩發酵菌。
二、試驗結果判斷:
接種微量新鮮培養物,35℃培養13小時,觀察結果。培養液變黃則為陽性,如為陰性,繼續?觀察至24h。
三、質控菌株:
陽性菌株:大腸埃希氏菌
陰性菌株:普通變形桿菌
四、使用說明:
(1)ONPG的優點為水解作用快。在有較多乳糖苷酶存在的情況下,可在數分鐘內被水解而變黃。將較大量細菌培??養物接種于小量ONPG培養基中,常可在1小時內獲得陽性結果。
(2)葡萄糖對β-半乳糖苷酶有一定的抑制作用,故應避免使用。
&n??bsp;(3)使用生長于含乳糖培養基的細菌進行接種,如三糖鐵瓊?脂斜面上的培養物,可能加速試驗反應。
(4)日本坂崎介紹,β-半乳糖苷酶和ONPG試驗反應不一定具有相?關性。Leminor氏等用腸道菌研究了兩者的相關性,他講ONPG試驗陽性菌分?為兩群。ONPG+β-gal+群細菌的ONPG試驗在4小時內為強陽性,但ONPG+β-gal-群細菌的ONPG試驗較弱,而且緩慢變為陽性。
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