1、VRBA培養相關問題
（1）所用器皿是否需要滅菌？
答：不需要。配制培養基所用到的錐形瓶、玻璃棒、勺子等均不需要滅菌，但要求一定要清洗干凈，表面無污漬、無殘留。煮沸完成后，取下錐形瓶，用一般常用的衛生紙（軟紙）覆蓋瓶口，用橡皮筋纏繞，待冷卻至適宜溫度即可傾注培養基。在?傾注培養基時，須點燃酒精燈，稍微灼燒錐形瓶口。
（2）如何保持“煮沸2min”？
答：可以用電磁爐或電熱板進行加熱煮沸，在該培養基即將煮沸時調低溫度。實際操作時??，不需要嚴格按照此要求進行，加熱煮沸數秒即可。原因：本培養基很難保持煮沸2min，一旦煮沸，則培養基很快上涌、翻騰，若不調低溫度或立刻采取其他措施，則培養基可在數秒內?噴涌出來，嚴重者可噴涌2米以上、電磁爐周圍1—2米范圍內都是培養基飛濺的范圍（實驗室危險因子之一）。
（3）若培養基未用完，是否可以冷藏起來下次用？
答：不可以。4789.28中已規定，??固體培養基最多允許熔融1次（指的是經過高壓滅菌冷卻后的培養基還可以熔融一次后使用）。且VRBA培養基冷卻后，再次熔融時非常容易噴涌，若溫度控制不當，底部培養基熔融后很快就會發生噴涌（即培養基未完全熔融就會發生噴涌現象）。
（4）傾注完成后是否需要“覆蓋一層”？如何覆蓋？
答：一般情況下不需要覆蓋。在?實際操作過程中，若檢驗員初次接觸該食品（或食品品類），則有必要在傾注培養基后再覆蓋一層（原因是不清楚該樣品是否會發生蔓延）。而如此往復測試幾次后，若該樣品或食品品類?均不存在蔓延現象，則以后的實驗中都不需要進行覆蓋。若重復多次測試后都有蔓延現象，則以后的檢驗中最好都進行覆蓋，最好是在原培養基已凝固或半凝固（不會發生晃動）時再傾注一層培養基（“一層”是指緩慢傾注培養基至培養基剛好能夠覆蓋整個平皿）。

2、如何確定培養基上長的是不是大腸菌群？
答：建議新手們認真按照標準進??行證實試驗，此證實試驗簡單易操作，每一次VRBA上有菌落生長都進行證實試驗，如此往復3-4次，對于哪種形態才是大腸菌群已經能夠了然??于心。

3、兩個梯度都長了菌，如何選取？
答：選取15-150CFU之間的平板（指的是VRBA平板上所有菌落數在此范圍），挑取可疑菌落進行證實試驗。詳細舉例說明：若有兩個連續梯度的4個平板上菌落數均在15-150之間，則4個平板上的菌落都要挑取進行證實試驗，實際操作時，可靈活操作，如：1:10的兩個平板上的菌落數分別為120、1??23，1:100的兩個平板的菌落數分別為16、18，嚴格來講必須至少在每個平板上分別挑取5個可疑菌落、5個典型菌落進行證實試驗，如此需要40根GBLB肉湯管。建議使用鎳合金接種環（即傳統的接種環，而不是一次性塑料接種環），因為VRBA上生長的菌落（無論典型或可疑）大部分長在底層、且菌落一般較大，被培養基覆蓋，傳統的接種環較細，用以刮去上層培養基較方便，挑取菌落也較方便。

4、如何進行證實試驗？菌落選取數量？
答：同上所述，建議新手們VRBA上的所有不同形態的菌落都進行證實試驗。每種不同形態?都挑取5-10個進行證實試驗（?若BGLB管足夠，建議多挑取幾個進行試驗）。
注意：A.每種可疑菌落挑取5個，每個菌落放入1管GBLB管中；B.“產氣者，記為大腸菌群陽性管”，就要求在實驗前須認真篩選BGLB管，凡產氣的GBLB管應棄去不??用。

5、結果如何計算？
答：首先，在VRBA培養24h后進行計數，分別計數可疑大腸菌群和典型大腸菌群（何為可疑、何為典型？同“2”，檢驗員多進行幾次實驗后自然很清楚典型的大腸菌群是何種形態）的數量。假如在1:10的平板上可疑大腸菌群有10個，典型大腸菌群有6個；其次，進行證實試驗，挑取上述可疑和典型大腸菌群各5個（或者全部挑取），假如10個可疑大腸菌群中有3個證實為陽性，6個典型大腸菌群中有5個證實為陽性，則計算方法如下：最終大腸菌群數=經證實的大腸菌群數=可疑??大腸菌群經證?實的數量+典型大腸菌群經證實的數量=10×（6/10）×10+6×（5/6）×10=110。

6、若平板上很多菌落，最終證實全部為陰性，結果如何計算？
答：根據第3條,選取適宜菌落數的平板挑取菌落進行證實試驗，若證實全部為陰性，則需要再挑取更低稀釋度的平板上的菌落（建議可疑和典型菌落分?別挑取10個）進行證實試驗，若第二次證實試驗均呈陰性，以＜1乘以最低稀釋度進行計算，如：1:10的平板菌落數分別為120、1??23，1:100的平板上菌落數分別為16、18，首先挑取1:100的兩個平板上的菌落進行證實試驗，若全部為陰性，再挑取1:10的兩個平板上的菌落進行證實試驗，若1:10的平板上的菌落數證實為陰性，則最終計算過程為＜1x10，最終結果為＜10；若1:10的的平板上的菌落有陽性管，則按照第5條進行計算。

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