1 范圍

本標準規定了食品中阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）的檢驗方法。

本標準適用于嬰幼兒配方食品、乳和乳制品及其原料中阪崎腸桿菌的檢驗。

2 設備和材料

除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：

2.1 恒溫培養箱：25 ℃±1 ℃，36 ℃±1 ℃，44 ℃±0.5 ℃。

2.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。

2.3 恒溫水浴箱：44 ℃±0.5 ℃。

2.4 天平：感量0.1 g。

2.5 均質器。

2.6 振蕩器。

2.7 無菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭。

2.8 無菌錐形瓶：容量100 mL、200 mL、2000 mL。

2.9 無菌培養皿：直徑90 mm。

2.10 pH 計或pH 比色管或精密pH 試紙。

2.11 全自動微生物生化鑒定系統。

3 培養基和試劑

3.1 緩沖蛋白胨水（buffer peptone water，BPW）：見附錄A 中A.1。

3.2 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素（modifi?ed lauryl sulfate trypt?ose broth-vancomycin

medium，mLST-Vm）：見附錄A 中A.2。

3.3 阪崎腸桿菌顯色培養基。

3.4 胰蛋白胨大豆瓊脂（trypticase soy agar，TSA）：見附錄A 中A.3。

3.5 生化鑒定試劑盒。

3.6 氧化酶試劑：見附錄A 中A.4。

3.7 L-賴氨酸脫羧酶培養基：見附錄A 中A.5。

3.8 L-鳥氨酸脫羧酶培養基：見附錄A 中A.6。

3.9 L-精氨酸雙水解酶培養基：見附錄A 中A.7。

3.10 糖類發酵培養基：見附錄A 中A.8。

3.11 西蒙氏檸檬酸鹽培養基：見附錄A 中A.9。

第一法阪崎腸桿菌的檢驗

4 檢驗程序

阪崎腸桿菌檢驗程序見圖1。

 

 

 

5 操作步驟

5.1 前增菌和增菌

取檢樣100 g（mL）加入已預熱至44 ℃裝有900 mL 緩沖蛋白胨水的錐形瓶中，用手緩緩地搖動至充分溶解，36 ℃±1 ℃培養18 h±2 h。移取1 mL 轉種于10 mL mLST-Vm 肉湯，44 ℃±0.5 ℃培養24 h±2h。

5.2 分離

5.2.1 輕輕混勻mLST-Vm 肉湯培養物，各取增菌培養物1 環，分別劃線接種于兩個阪崎腸桿菌顯色培養基平板??，36 ℃±1 ℃培養24 ?h±2 h。

5??.2.2 挑取1 個～5 個可疑菌落，劃線接種于TSA 平板。25 ℃±1 ℃培養48 h±4 h。

5.3 鑒定

自TSA 平板上直??????????????????????????接挑取黃色可疑菌落?，進行生化鑒定。阪崎腸桿菌的主要生化特征見表1。可選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統。

第二法 阪崎腸桿菌的計數

7 操作步驟

7.1 樣品的稀釋

7.1.1 固體和半固體樣品：無菌稱取樣品100 g、10 g、1 g 各三份，加入已預熱至44 ℃分別盛有900 mL、90 mL、9 mL BPW 中，輕輕振搖使充分溶解，制成1:10 樣品勻液，置36 ℃±1 ℃培養18 h±2 ?;h。分別移取1 mL 轉種于10 mL mLST-Vm 肉湯，44 ℃±0.5 ℃培養24 h±2 h。

7.1.2 液體樣品：以無菌吸管分別取樣品100 mL、10 mL、1 mL 各三份，加入已預熱至44 ℃分別盛有900 mL、90 mL、9 mL BPW 中，輕輕振搖使充分混勻，制成1:10 樣品勻液，置36 ℃±1 ℃培養18h±2h。分別移取1 mL 轉種于??10 mL mLST-Vm 肉湯，44 ℃±0.5 ℃培養24 h±2 h。

7.2 分離、鑒定

同5.2，5.3。

8 結果與報告

綜合菌落形態、生化特征，根據證實為阪崎腸桿菌的陽性管數，查MPN 檢索表，報告每100 g（mL）樣品中阪崎腸桿菌的MPN 值（見附錄Ｂ中表B.1）

附錄A

（規范性附錄）

培養基和試劑

A.1 緩沖蛋白胨水（BPW）

A.1.1 成分

蛋白胨 10.0g

氯化鈉 5.0 g

磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O） 9.0 g

磷酸二氫鉀 1.5 g

蒸餾水 1 000 mL

pH 7.2

A.1.2 制法

加熱攪拌至溶解,調節pH，121 ℃高壓滅菌15 min。

A.2 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素（Modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycinmedi?um，mLST-Vm）

A.2.1 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（mLST）肉湯

A.2.1.1 成分

氯化鈉 34.0 g

胰蛋白胨 20.0 g

乳糖 5.0 g

磷酸二氫鉀 2.75 g

磷酸氫二鉀 2.75 g

十二烷基硫酸鈉 0.1 g

蒸餾水 1 000 mL

pH 6.8±0.2

A.2.1.2 制法

加熱攪拌至溶解，調節 pH。分裝每管10 mL，121 ℃高壓滅菌15 min。

A.2.2 萬古霉素溶液

A.2.2.1 成分

萬古霉素 10.0 mg

蒸餾水 10.0 mL

A.2.2.2 制法

10.0 mg 萬古霉素溶解于10.0 mL 蒸餾水，過濾除菌。萬古霉素溶液可以在0 ℃～5 ℃保存15 天。

A.2.3 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素（Modified lauryl sulfate&nb?sp;tr??yptose broth-vancomycinmedium，mLST-Vm）

每 10 mL mLST 加入萬古霉素溶液0.1 mL，混合液中萬古霉素的終濃度為10 μg/ mL。

注：mLST-Vm 必須在24 h 之內使用。

A.3 胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）

A.3.1 成分

胰蛋白胨 15.0 g

植物蛋白胨 5.0 g

氯化鈉 5.0 g

瓊脂 15.0 g

蒸餾水 1 000 mL

pH 7.3±0.2

A.3.2 制法

加熱攪拌至溶解?，煮沸&?nbsp;1 min，調節pH，121 ℃高壓15 min。

A.4 氧化酶試劑

A.4.1 成分

N,N,N',N'-四甲基對苯二胺鹽酸鹽 1.0 g

蒸餾水 100 mL

A.4.2 制法

少量新鮮配制，于冰箱內避光保存，在 7 d 之內使用。

A.4.3 試驗方法

用玻璃棒或一次性接種針挑取單個特征性菌落，涂布在氧化酶試劑濕潤的濾紙平板上。如果濾紙在10 s?? 之內未變為紫紅??色、紫色或深藍色，則為氧化酶試驗陰性，否則即為氧化酶實驗陽性。

注：實驗中切勿使用鎳/鉻材料。

A.5 L-賴氨酸脫羧酶培養基

A.5.1 成分

L-賴氨酸鹽酸鹽（L??-lysine monohydrochloride） 5.0 g

酵母浸膏 3.0 g

葡萄糖 1.0 g

溴甲酚紫 0.015 g

蒸餾水 1 000 mL

pH 6.8±0.2

A.5.2 制法

將各成分加熱溶解，必要時調節 pH。每管??分??裝5 mL，121 ℃高壓15 min。

A.5.3 實驗方法

挑取培養物接種于 L-賴氨酸脫羧酶培養基，剛好在液體培養基的液面下。30 ℃±1 ℃培養24 h±2 h，觀察結果。??L-賴氨酸脫羧酶試驗陽性者，培養基呈紫色，陰性者為黃色。

A.6 L-鳥氨酸脫羧酶培養基

A.6.1 成分

L-鳥氨酸鹽酸鹽??（L-ornithine monohydrochloride） ??5.0 g

酵母浸膏 3.0 g

葡萄糖 1.0 g

溴甲酚紫 0.015 g

蒸餾水 1 000 mL

pH 6.8±0.2

A.6.2 制法

將各成分加熱溶解，必要時調節 pH。每管分裝5?? mL。121 ℃高壓15? min。

A.6.3 實驗方法

挑取培養物????接種于 L-鳥氨酸脫羧酶培養基，剛好在液體培養基的液面下。30 ℃±1 ℃培養24 h±2 h，觀察結果。L-鳥氨酸脫羧酶試驗陽性者，培養基呈紫色，陰性者為黃色。

A.7 L-精氨酸雙水解酶培養基

A.7.1 成分

L-精氨酸鹽酸鹽??（L-argi?nine monohydrochloride） 5.0 g

酵母浸膏 3.0 g

葡萄糖 1.0 g

溴甲酚紫 0.015 g

蒸餾水 1 000 mL

pH 6.8±0.2

A.7.2 制法

將各成分加熱溶解，必要時調節 pH。每管分裝5 mL。121 ℃高壓15 min?。

A.7.3 實驗方法

挑取培養物接種于 L-精氨酸脫羧酶培養基，剛好在液體培養基的液面下。30 ℃±1&?nbsp;℃培養24 h±2&??nbsp;h，觀察結果。L-精氨酸脫羧酶試驗陽性者，培養基呈紫色，陰性者為黃色。

A.8 糖類發酵培養基

A.8.1 基礎培養基

A.8.1.1 成分

酪蛋白（酶消化） 10.0 g

氯化鈉 5.0 g

酚紅 0.02 g

蒸餾水 1 000 mL

pH 6.8±0.2

A.8.1.2 制法

將各成分加熱溶解，必要時調節 pH。每管分裝5 mL。121 ℃高壓15 min。

A.8.2 糖類溶液（D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙）

A.8.2.1 成分

糖 8.0 g

蒸餾水 100 mL

A.8.2.2 制法

分別稱取 D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙等糖類成分各8 g，溶于100 mL 蒸餾水中，過濾除菌，制成80 mg/mL 的糖類溶液。

A.8.3 完全培養基

A.8.3.1 成分

基礎培養基 875 mL

糖類溶液 125 mL

A.8.3.2 制法

無菌操作，將每種糖類溶液加入基礎培養基，混勻；分裝到無菌試管中，每管 10 mL。

A.8.4 實驗方法

挑取培養物接種于各種糖類發酵培養基，剛好在液體培養基的液面下。30 ℃±1 ℃培養24 h±2 h，觀察結果。糖類發酵試驗陽性者，培養基呈黃色，陰性者為紅色。

A.9 西蒙氏檸檬酸鹽培養基

A.9.1 成分

檸檬酸鈉 2.0 g

氯化鈉 5.0 g

磷酸氫二鉀 1.0 g

磷酸二氫銨 1.0 g

硫酸鎂 0.2 g

溴百里香酚藍 0.08 g

瓊脂 8.0 g～18.0 g

蒸餾水 1 000 mL

pH 6.8±0.2

A.9.2 制法

將各成分加熱溶解，必要時調節 pH。每管分裝10 mL，121 ℃高壓15&??nbsp;min，制成斜面。

A.9.3 實驗方法

挑取培養??物接種于整個培養基斜面，36 ℃±1 ℃培養24 h±2 h，觀察結果。陽性者培養基變為藍色。

附錄B

（規范性附錄）

阪崎腸桿菌最可能數（MPN）檢索表

B.1 阪崎腸桿菌最可能數（MPN）檢索表

每100 g（mL）檢樣中阪崎腸桿菌最可能數（MPN）的檢索見表B.1。

 

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