本法?系采用酶聯免疫法測定大腸桿菌表達系統生產的重組制品中菌體蛋白質殘留量。

   試劑（1)包被?液（P H9.6碳酸鹽緩沖液） 稱取碳酸鈉0.32g、碳酸氫鈉0 .5 8 6 g ,置200ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度。

   (2 )磷酸鹽緩沖液（p H 7 . 4 )稱取氯?化鈉8g、氯化鉀0.2g、磷酸氫二鈉1.44g、磷酸二氫?鉀0.24g，加水溶解并稀釋至500ml, 121°C滅菌15分鐘。

   (3 )洗滌液（pH7.4) 量取聚山梨酯20 0.5ml，加磷酸鹽緩沖液至50??0ml。

   (4 )稀釋液（p H ??;7 . 4 )稱取牛血清白蛋白0.5g，加洗滌液溶解并稀釋至100ml。

   (5 )濃稀釋液稱取牛血清白蛋白l.O g? , 加洗滌液溶解并稀釋至100ml。

   (6 )底物緩沖液（pH 5 .0枸櫞??酸-磷酸鹽緩沖液） 稱取磷酸氫二鈉（Na2HP04 . 12H20 )??1 . 84g、枸櫞酸 0. 51g，加水溶解并稀釋至100ml。

   (7 )底物液??取鄰苯二胺8mg、30%過氧化氫30^1，溶于底物緩沖液20ml??中。臨用時現配。

   (8 )終止液lm o l/L硫酸溶液。標準品溶液的制備按菌體蛋白質標準品說明書加水?復溶，精密量取適量，用稀釋液稀釋成每lm l中含菌體蛋白質500ng、250ng、125ng、62. 5ng、31. 25ng、15. 625ng, 7. 8125ng的溶液。

   供試品溶液的制備 取供試品適量，用稀釋液稀釋成每lml中約含250μg的溶液。如供試品每lml中含量小于500μg時，用濃稀釋液稀釋1倍。

   測定法 取兔抗大腸桿菌菌體蛋白質抗體適量，用包被液溶解并稀釋成每lml中含10μg的溶液，以100μl/孔加至9 6孔酶標板內，4℃放置過夜（16〜18小時）。用洗滌液洗板3次；用洗滌液制備1%牛血清白蛋白溶液，以200μl/孔加至酶標板內，37℃放置2 小時；將封閉好的酶標板用洗滌液洗板3 次；以100μl/孔加人標準品溶液和供試品溶液，每個稀釋度做雙孔，同時加入2 孔空白對照（稀釋液），37°C放置2 小時；用稀釋液稀釋辣根過??氧化物酶（HRP)標記的兔抗大腸桿菌菌體蛋白質抗體1000倍，以100μl/ 孔加至酶標板內，37°C放置1 小時，用洗滌液洗板1 0次??，以lOOμl/

孔加人底物液，3 7 ℃避光放置4 0 分鐘，以5 0 μl/孔加入終止液終止反應。用酶標儀在波長4 9 2&nb?sp;n m 處測定吸光度，應用計算機分析軟件進行讀數和數據分析，也可使用手工作圖法計算。

   以標準品溶液吸光度對其相應的濃度作標準曲線，并以??供試品溶液吸光度在標準曲線上得到相應菌體蛋白質含量，

按以下公式計算：

   供試品菌體蛋白質殘留量（％) = （c×n）/（T×106）×100

式中  c為供試品溶液中菌體蛋白質含量，ng/ml;

      n為供試品稀釋倍數；

      T為供試品蛋白質含量，mg/ml。

注：也可采用經驗證的酶聯免疫試劑盒進行測定。

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