1 范圍

 &nb??sp;本標準規定了出入境口岸軍團菌檢驗對象、方法、結果報告、生物安全要求及陽性結果判定、處置。

  本標準適用于出入境口岸軍團菌的檢驗。

2 規范性引用文件

  下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協議的各方?研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是??未注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。

  GB19489 實驗室 生物安全通用要求

  WS195 軍團病診斷標準及處理原則

3 術語和定義

  下列術語和定義適用于本標準。

3.1

  軍團病

  軍團菌屬（主要是軍團菌）引起的細菌性呼吸道傳染病，臨床表現有兩種類型，非肺炎型和肺炎???型。

3.2

  軍團菌

 &nb??sp;引起軍團病的病原菌，系兼性細胞內寄生的?革蘭氏陰性桿菌，軍團菌是人軍團菌是人軍團病的主要致病菌。

4 實驗室生物安全防護

  實驗室結構和設施、安全操作規程、安全設備及個體防護應符合GB19489中二級生物安全防護實驗室的要求。

5 對象

5.1 疑似感染軍團菌的出入境人員。

5.2 環境污染標本。

6 準備

6.1 檢驗試劑

6.1.1 細菌培養鑒定及聚合酶鏈反應（PCR）試劑的制備參見附錄A，或購買符合要求的商品化檢測試劑盒。

6.1.2 直接熒光抗體染色（DFA）、血清學檢驗及尿抗原檢測見WS195或購買符合要求的商品化試劑。

6.2 儀器設備

  儀器設備參見附錄A。

7 標本的采集和處理

7.1 疑似感染者標本的采集

7.1.1 發病期患者的痰液、纖支鏡毛刷標本、支氣管灌洗液和肺組織可??進行病原學檢測，常規采樣后立即送檢，采樣過程中應使用無菌蒸餾水。

7.1.2 無菌方法采集發病期患者胸水，用有蓋無菌試管保存，立即送檢。

7.1.3 用于培養的尿液標本采樣前應清洗并消毒患者尿道口，留取中段尿10ml~20ml，于無菌容器中，立即送檢。用于尿抗原檢測的標本可常規留取中段尿。

7.1.4 用不抗凝的真空管采集并保存患者急性期（發病3d內）、第3周、第6周血清用于血清學檢測。

7.2 疑似感染者標本的處理

7.2.1 肺組織用蒸餾水在無菌條件下制成懸液，痰液、纖支鏡毛刷標本、支氣管灌洗液、肺組織懸液經酸處理或熱處理??后進行培養（見7.5）。

7.2.2 無菌方法采集的胸水、消毒尿道口留取的中段尿，血液等正常情況下無菌的標本無需處理直接用于培養。

7.2.3 血清學試驗的血液采集后室溫放置1h后，3000r/min離心5min，，分離出血清。

7.3 環境污染標本采集

  水樣用于無菌容器采集200ml~500ml，塵土和泥土用于無菌蒸餾?水制成懸液。水樣中如果含有含氯或其他氧氣指示劑，應??在取樣時或取樣前加入硫代硫酸鉀或相應的活性試劑中和。從樣品采集，濃縮到送檢間隔不超過2d，實驗室接到水樣后應盡快進行微生物學分析。

7.4 環境污染標本處理

7.4.1 膜過濾法

   采用膜過濾裝置進行膜過濾，采用直徑47mm~147mm，孔徑0.22μm的膜。過濾后的膜應放置在帶蓋的無菌容器中，可用無菌剪刀剪碎，加15ml的無菌稀釋液或無菌蒸餾水，不斷搖動至少2min。也可將容器放入超聲波中10，min。

7.4.2 離心法

  取200ml樣品于300nl~500ml容器的離心瓶中，6000r/min離心10min或3000r/min離心30min,保持溫度在15℃~25℃，棄去上清液，將沉淀物懸浮在15ml無菌蒸餾水中。

7.5 酸處理和熱處理

7.5.1 處理目的

  ??;為減少痰液、纖支鏡毛刷??標本、支氣管灌洗液和肺組織懸液等正常情況有菌的標本和環境污染的標本中的雜菌生長，標本需進行酸處理或熱處理。同一容器內的標本只能選擇酸處理或熱處理中的一項，兩種處理方法不能重復。

7.5.2 酸處理

  取患者痰液、纖支鏡毛刷標本、支氣管灌洗液和肺組織懸液等標本2ml，轉移至有蓋無菌試管中。取經7.4處理過的環境污染標本10ml，轉移至有蓋無菌試管中，3000r/min離心30min,用無菌槍頭吸去8ml體積的上清液，通過渦旋重新懸浮剩余物。每個裝有2ml標本的有蓋無菌試管中加入8mlpH2.0酸性緩沖液，混勻，室溫靜置10min。加入堿中和試劑，調至未加酸性緩沖液時的pH值，靜置10min，待查。

7.5.3 熱處理

  取患者痰液、纖支鏡毛刷標本、支氣管灌洗液和肺組織懸液等臨床標本或環境污染標本2ml，轉移至有蓋無菌容器中，50℃±1℃水浴處理30min±2min。

8 實驗室檢驗方法

8.1 細菌培養鑒定，見附錄B。

8.2 尿液中抗原的檢測，采用免疫層析法，按照相應商品化試劑說明書。

8.3 聚合酶鏈反應（PCR）檢測，參見附錄D。

8.4 直接熒光抗體染色按照WS195.

8.5 血清學檢測按照WS195或按照商品化試劑說明書。

   注：其他符合檢測要求的商品化試劑盒，在??驗證合格后均可參照使用，本標準不做推薦。

9 結果判定與報告

9.1 細菌培養鑒定報告

9.1.1 標本中培養出軍團菌，報告“細菌培養檢出軍團菌”。

9.1.2 BCYEα培養基或GVPC培養基14d內未見可疑菌落，報告“細菌培養14d，位檢出軍團菌”。

9.2 尿抗原檢測報告

9.2.1 尿抗原檢測陽性，報告“尿軍團菌抗原陽性”。

9.2.2 尿抗原檢測陰性，報告“尿軍團菌抗原陰性”。

9.3  PCR檢驗報告

9.3.1  PCR檢測陽性，報告“軍團菌PCR檢測陽性”。

9.3.2  PCR檢測陰性，報告“軍團菌PCR檢測陰性”。

9.4 血清學試驗報告

9.4.1 血清學試驗陽性，報告“軍團菌抗體陽性”。

9.4.2 血清學試驗陰性，報告“軍團菌抗體陰性”。

10 陽性結果的處置

10.1 細菌分離培養陽性的菌株應傳代保存，疫情報告上級主管部門，同?時向當地衛生行政主管部門??疾病預防控制中心通報。

10.2 血清學檢測、尿抗原檢測結果陽性或可疑陽性的標本，宜選擇直接免疫熒光抗體染色及細菌分離培養和PCR方法進行復檢驗證。

附錄A略。

附錄B

細菌培養鑒定

B.1初培養

  將酸處理或熱處理的標本3000r/min離心10min，用無菌吸管吸棄上清液，保留1ml重新懸浮沉淀物，正常情況無菌的標本直接用于培養，用無菌吸管吸取沉淀物懸液或正常的標本，分別滴加1滴~2滴在BCYEα軍團菌專用培養基和GVPC選擇性培養基上，劃線接種或涂布接種。35℃，5%CO2培養箱中培養，連續觀察3d~7d，軍團菌在BCYEα培養基上菌落通常呈現白色、灰色、藍色、紫色，但也可能出現棕色粉??色灰綠色或深紅色。軍團菌表面光滑，邊緣整齊，出現典型的毛玻??璃現象。發現上述菌落即為軍團菌可疑菌落，進行下一步分離培養鑒定。無可疑菌落，培養順延至14d，報告“細菌培養14天，未檢出軍團菌”。

B.2 分離培養

  挑取初培養可疑菌落分別在BCYEα培養基和BCYE-Cys培養基或血平板上劃線接種。35℃，5%CO2培養箱中培養，觀察2d~4d，在BCYEα培養基上見到菌落形成而BCYE-Cys培養基或血平板上未見生長，即初步判定為軍團菌，??用軍團菌診斷血清做分型試驗進一步驗證。聚合酶鏈反應可輔助用于軍團菌到鑒定，作為參??考。

附錄C略。

附錄D略。

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