一、實驗目的和內容
目的：了解并掌握菌種保藏的常用方法及其優缺點。
內容：1、學習斜面傳代保藏方法。
2、學習液體石蠟保藏方法。
3、學習沙土管保藏方法。
4、學習冷凍干燥保藏方法。
二、實驗材料和用具
細菌、酵母菌、放線菌和霉菌斜面菌；
牛肉膏蛋白胨培養基斜面(培養細菌)，麥芽汁培養基斜面(培養酵母菌)，高氏1號培養基斜面(培養放線菌)，馬鈴薯蔗糖培養基斜面(培養絲狀真菌)。
無菌水、液體石蠟、P2O5、脫脂奶粉、10%HCl、干冰、95%乙醇、食鹽、河沙、瘦黃土(有機物含量少的黃土)；
無菌試管、無菌吸管(1mL及5mL)、無菌滴管、接種環、40目及100目篩子、干燥器、安瓿管、冰箱、冷凍真空干燥裝置、酒精噴燈、三角燒瓶(250mL)。
三、操作步驟
下列各方法可根據實驗室具體條件與需要選做。
(一)斜面傳代保藏法
l．貼標簽   取各種無菌斜面試管數支，將注有菌株名稱和接種日期的標簽貼上，貼在試管斜面的正上方，距試管口2～3cm處。
2．斜面接種  將待保藏的菌種用接種環以無菌操作法移接至相應的試管斜面上，細菌和酵母菌宜采用對數生長期的細胞，而放線菌和絲狀真菌宜采用成熟的袍子。
3．培養  細菌37℃恒溫培養18～24h，酵母菌于28～30℃培養36～60h，放線菌和絲狀真菌置于28℃培養4～7d。
4．保藏  斜面長好后，可直接放入4℃冰箱保藏。為防止棉塞受潮長雜菌，管口棉花應用牛皮紙包扎，或換上無菌膠塞，亦可用熔化的固體石蠟熔封棉塞或膠塞。
保藏時間依微生物種類而不同，酵母菌、霉菌、放線菌及有芽抱的細菌可保存2～6個月，移種一次；而不產芽孢的細菌最好每月移種一次。此法的缺點是容易變異，污染雜菌的機會較多。
(二)液體石蠟保藏法
l．液體石蠟滅菌  在250mL三角燒瓶中裝入100mL液體石蠟，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎，12l℃濕熱滅菌30min，然后于40℃溫箱中放置l4d(或置于105～110℃烘箱中lh)，以除去石蠟中的水分，備用。
2．接種培養   同斜面傳代保藏法。
3．加液體石蠟  用無菌滴管吸取液體石蠟以無菌操作加到已長好的菌種斜面上，加入量以高出斜面頂端約1cm為宜。
4．保藏   棉塞外包牛皮紙，將試管直立放置于4℃冰箱中保存。
利用這種保藏方法，霉菌、放線菌、有芽孢細菌可保藏2年左右，酵母菌可保藏1～2年，一般無芽孢細菌也可保藏1年左右。
5. 恢復培養  用接種環從液體石蠟下挑取少量菌種，在試管壁上輕靠幾下，盡量使油滴凈，再接種于新鮮培養基中培養。由于菌體表面粘有液體石蠟，生長較慢且有粘性，故一般須轉接2次才能獲得良好菌種。
(三)沙土管保藏法
l．沙土處理
(1)沙處理：取河沙經40目過篩，去除大顆粒，加10%HCl浸泡(用量以浸沒沙面為宜)2～4h(或煮沸30min)，以除去有機雜質，然后倒去鹽酸，用清水沖洗至中性，烘干或曬干，備用。
(2)土處理：取非耕作層瘦黃土(不含有機質)，加自來水浸泡洗滌數次，直至中性，然后烘干，粉碎，用100目過篩，去除粗顆粒后備用。
2．裝沙土管  將沙與土按2：1，3：1或4：1(W/W)比例混合均勻裝入試管中(10mm×100mm，裝置約7cm高，加棉塞，并外包牛皮紙，12l℃濕熱滅菌30min，然后烘干。
3．無菌試驗  每10支沙土管任抽一支，取少許沙土接入牛肉膏蛋白胨或麥芽汁培養液中，在最適的溫度下培養2～4d，確定無菌生長時才可使用。若發現有雜菌，經重新滅菌后，再作無菌試驗，直到合格。
4．制備菌液  用5mL無菌吸管分別吸取3mL無菌水至待保藏的菌種斜面上，用接種環輕輕攪動，制成懸液。
5．加樣  用1mL吸管吸取上述菌懸液0.1～0.5mL加入沙土管中，用接種環拌勻。加入菌液量以濕潤沙土達2/3高度為宜。
6．干燥  將含菌的沙土管放入干燥器中，干燥器內用培養皿盛P2O5作為干燥劑，可再用真空泵連續抽氣3～4h，加速干燥。將沙土管輕輕一拍，沙土呈分散狀即達到充分干燥。
7．保藏  沙土管可選擇下列方法之一來保藏：
(1)保存于干燥器中；
(2)用石蠟封住棉花塞后放入冰箱保存；
(3)將沙土管取出，管口用火焰熔封后放入冰箱保存；
(4)將沙土管裝入有CaCl2等干燥劑的大試管中，塞上橡皮塞或木塞，再用蠟封口，放入冰箱中或室溫下保存。
8．恢復培養  使用時挑取少量混有孢子的沙土，接種于斜面培養基上，或液體培養基內培養即可，原沙土管仍可繼續保藏。
此法適用于保藏能產生芽孢的細菌及形成孢子的霉菌和放線菌，可保存2年左右。但不能用于保藏營養細胞。
(四)冷凍干燥保藏法
1．準備安瓿管  選用內徑5mm，長10.5cm的硬質玻璃試管，用10%HCl浸泡8～10h后用自來水沖洗多次，最后用去離子水洗1～2次，烘干，將印有菌名和接種日期的標簽放人安瓿管內，有字的一面朝向管壁。管口加棉塞，121℃滅菌30min。
2．制備脫脂牛奶  將脫脂奶粉配成20%乳液，然后分裝，121℃滅菌30min，并作無菌試驗。
3．準備菌種 選用無污染的純菌種，培養時間，一般細菌為24～48h，酵母菌為3d，放線菌與絲狀真菌7～10d。
4．制備菌液及分裝  吸取3mL無菌牛奶直接加入斜面菌種管中，用接種環輕輕攪動菌落，再用手搖動試管，制成均勻的細胞或孢子懸液。用無菌長滴管將菌液分裝于安瓿管底部，每管裝0.2mL。
5. 預凍 將安瓿管外的棉花剪去并將棉塞向里推至離管口約15mm處(圖24—2A)，再通過乳膠管把安瓶管連接于總管的側管上，總管則通過厚壁橡皮管及三通短管與真空表及干燥瓶、真空泵相連接(圖24—1)，并將所有安瓶管浸入裝有干冰和95%乙醇的預冷槽中，(此時槽內溫度可達-40～-50℃)，只需冷凍1h左右，即可使懸液凍結成固體。
6. 真空干燥   完成預凍后，升高總管使安瓿管僅底部與冰面接觸，(此處溫度約-10℃)，以保持安韶管內的懸液仍呈固體狀態。開啟真空泵后，應在5～15min內使真空度達66.7Pa以下，使被凍結的懸液開始升華，當真空度達到26.7～13.3Pa時，凍結樣品逐漸被干燥成白色片狀，此時使安瓿管脫離冰浴，在室溫下(25~30℃)繼續干燥(管內溫度不超過30C)，升溫可加速樣品中殘余水分的蒸發。總干燥時間應根據安瓿管的數量，懸浮液裝量及保持劑性質來定，一般3~4h即可。
7．封口樣品  干燥后繼續抽真空達1.33Pa時，在安瓿管棉塞的稍下部位用酒精噴燈火焰灼燒，拉成細頸并熔封(圖24-2B、C)，然后置4℃冰箱內保藏。
8．恢復培養   用75%乙醇消毒安瓿管外壁后，在火焰上燒熱安瓿管上部，然后將無菌水滴在燒熱處，使管壁出現裂縫，放置片刻，讓空氣從裂縫中緩慢進入管內后，將裂口端敲斷，這樣可防止再用無菌的長頸滴管吸取菌液至合適培養基中，放置在最適溫度下培養。
冷凍干燥保藏法綜合利用了各種有利于菌種保藏的因素(低溫、干燥和缺氧等)，是目前最有效的菌種保藏方法之一。保存時間可長達10年以上。
四、注意事項
1．從液體石蠟封藏的菌種管中挑菌后，接種環上帶有油和菌，故接種環在火焰上滅菌時要先在火焰邊烤干再直接灼燒，以免菌液四濺，引起污染。
2．在真空干燥過程中安瓿管內樣品應保持凍結狀態，以防止抽真空時樣品產生泡沫而外溢。
3．熔封安瓿管時注意火焰大小要適中，封口處灼燒要均勻，若火焰過大，封品處易彎斜，冷卻后易出現裂縫而造成漏氣。
五、演示
1．冷凍真空干燥裝置的連接及使用。
2．熔封安瓿管操作。
六、實驗報告
七、問題和思考
1．如何防止菌種管棉塞受潮和雜菌污染？
2．冷凍干燥裝置包括哪幾個部件？各個部件起什么作用？
3．現有一個纖維素酶的高產霉菌菌株，你選用什么方法保存？試設計一個實驗方案。
  
   

 

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