??1. 藥典要求（培養基）配制后應采用驗證合格的滅菌程序滅菌，是否可以按照培養基說明說書上的方式進行滅菌而不用進行驗證？如需驗證，是否每種培養基都至少要做三批？高壓滅菌器的蒸汽循環系統的驗證該怎么做？

??答：培養基說明書上的滅菌方法僅僅只是供應商推薦的方法，不同的實驗室應對選定的滅菌程序經過驗證。每種培養基至少要做多少批沒有明確的規定。蒸汽循環系統的驗證應考慮熱分布、熱穿透和生物挑戰性實驗結果。

2. 消毒液有效期的驗證等微生物實驗室的支持驗證體系能否詳細的講解一下？

答：消毒液有效期驗證可參見消毒技術規范（2008）。其他微生物實驗室支持系統的驗證涉及的內容較多，擬考慮設專題討論。

3. 表面微生物驗證方法？

答：擬考慮設專題討論。

1、微生物方法驗證，要求菌株回收率≧70%，是否有上限要求？（如不得高于100%或者110%）。

答：沒有上限。但一般不會高于100%，因為加進去的菌量是一樣的，如果超過100%可看成是操作上的誤差。按微生物的特性，如果不超過太多，是可以接受的，但沒有具體上限。（本所控制在110%以內）。

2?、在微生物方法驗證時，霉菌、酵母菌計數驗證只用黑曲霉及白色念珠菌做方法學驗證，在操作培養過程中發現：在玫瑰紅鈉瓊脂培養生長的白色念珠菌的形態太小與營養瓊脂上培養的細菌的某些形態大小相同，這樣如何判斷營養瓊脂上生長的菌落是否是白色念珠菌？為何這兩種菌落形態相似？

?答：菌落形態相似不等于就是同一種菌。在驗證時，營養瓊脂的驗證菌株為大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，如果本底菌為0??，則營養瓊脂上長的菌應該不是白色念珠菌。要判斷是否為白色念珠菌，應進行白色念珠菌的相應鑒定方法后才能確定。任何微生物都不可能只是從菌落就可以進行判斷，只能判斷為疑似，然后再做一系列相應的鑒定實驗后才能進行判斷。

3、生孢梭菌的適宜計數用培養基？（很多驗證需對生孢梭菌進行計數）

??答：最簡便的方法是用硫乙醇酸鹽流體培養基。該培養基上層為含氧層，適宜需氧菌生長，下層為厭氧層（下層高度最好7cm以上），適宜厭氧菌生長。在培養16~18小時這個時間進行觀察，計數，超過20小時,??由于繁殖量大，培養基將混濁，點計不清。或者是用哥倫比亞瓊脂培養基，澆注后，置厭氧罐（袋）里，再置培養箱培養，計數。

4、微生物限度檢查法中所用的培養基要進行適用性檢查試驗，請問這些培養基還需要做無菌檢查試驗嗎？

??答：微生物限度檢查，藥典上沒有特別說明對培養基作無菌性檢查，但每次都要做陰性對照實驗，陰性對照是檢查整個檢驗系統是否被微生物污染，實際上也包括了培養基的無菌性檢查。

5、微生物限度檢查法中所用的培養基如：營養瓊脂、EMB、Macl等培養基其分裝容器需要預先滅菌嗎？

答：不用。只要是潔凈的就行，因為分裝后還要滅菌。

6?、具有抑菌性的供試品，細菌、霉菌、都是用薄膜過濾法來檢查的，那么沙門菌可以用常規法來檢查嗎？就是可以不經過過濾直接接種到營養肉湯中嗎？

??答：這要看你驗證的結果。如果通過驗證，你的品種是對沙門菌有抑制作用，且用培養基稀釋法不能消除其抑菌性，則就必需考慮用薄膜過濾法。

7、微生物限度檢查中，稀釋劑對照組，是在稀釋液中加入50~100cfu的菌，還是把稀釋液制成含量50~100cfu的濃度呢？

答：是把稀釋液制成含50~100cfu/ml菌的濃度。（在這里，我對上次講課時關于稀釋劑對照組操作的PPT進行糾正，對于離心+薄膜過濾法的稀釋劑對照組的操作應該是：含50~100cfu/ml菌的稀釋液 離心 取稀釋液（與試驗組同樣取上層液） 過濾、沖洗 貼平板）

8、稀釋級對照組:含50~100cfu/ml菌稀釋液→離心→取供試液+稀釋液 過濾、沖洗→貼平板。這里需要加供試液嗎？是否應為上述離心后的菌液？

答：不需要取供試液，只取“上述離心后的菌液”。關于這一情況，我在第7題里已經作了說明。

9、當要做稀釋劑對照組時，是否就是從制備供試品時就同時做一份不含供試品而是含菌50~100cfu的樣品？等于按同一個方法制備一個供試品，五個含菌稀釋液對照組？

答：是的。

10、菌落計數是否需要將每天計數的數據登記在記錄本上，是否可以只記錄最終的數據？

??答：可以。每天計數的目的是預防菌落彌漫互相覆蓋，干擾最終的點計。你可以用油性筆將每天點計的數記錄在培養皿上，發報告時只要最終菌落數就行了。

11?、若樣品中有不溶物（如片劑中的輔料顆粒），經常會影響培養前期的結果，藥典要求逐日計數，所以報告中會出現第二、三日菌落數小于第一日的現象，請問該如何向客戶或監檢機構解釋這種結果？或者是否可以不計第一、二日菌落數，待輔料顆粒與菌落可以區分后再計數？

答：報告書不需要顯示第一、第二天的結果，只需報告最終結果。理由請見第9題答復。或者是在營養瓊脂中加入TTC試劑（每100ml加入0.1%）

12??、由于微生物檢驗的特殊性，對于樣品的微生物限度檢查計數數據是否可登記在表格內（此表格僅含樣品名稱、批號及檢查結果）。之后再將檢測結果移至詳細記錄中？

答：原始記錄應該只有1份。如果你說的詳細記錄是屬于一般記錄，是沒有必要的，如果是指報告書，就應該沒問題。這要看你自己訂的SOP。

13、直接接種法培養后的菌落報告：原液230cfu,稀釋10倍后 40cfu,請問按2010版藥典的菌落數報告規則如何報告菌落數？

答：報告菌落數為40×10=400cfu。應以菌落數乘以稀釋倍數后的最大值作為報告結果。

14、05版藥典供試品離心5分鐘，而10版藥典改用離心3分鐘，原來按5分鐘驗證的產品是否需要重新驗證？

答：是的。需要再確認一下。

15、10版藥典附錄微生物限度檢查法中結果判斷的菌落計數單位是以“cfu”表示，但正文品種項下是以“個”表示，最終應以哪位為準呢？

答：應該是以cfu?為單位。正文是由于印刷時沒統一修改過來，關于這個問題，在增補本上修訂過來。（在增補本沒出來之前，正文品種還是以個為單位）

16、為何控制菌液的濃度為50-100cfu/ml。

答：50-100cfu在平板上比較好點計，菌落不容易重疊。少于50，則實驗誤差會增大，重現性不好，大于100則容易造成菌落太密或重疊不好計數。

17??、藥典上控制菌檢查的方法驗證，只是說把菌加至增菌培養基中檢出即可，那龙8娱乐官方网站實際做驗證與記錄時，是否要做增菌以后的步驟呢？

答：要。不然你怎么知道檢出來的菌是你加進去的試驗菌呢？

18、采用薄膜過濾法檢驗，陽性菌，計數是否也用此方法計數？

答：是的。

19、對于10版藥典延長培養時間，控制菌35-37℃改為30-35℃培養溫度，一些已經驗證（按05版藥典）檢品是否需要重新驗證？是否有必要進行延長時間前后菌生長情況變化的驗證試驗？

答：目前沒有相關性規定，龙8娱乐官方网站認為可按原來已經驗證的方法，用2010年版的培養時間和溫度再確認一下，如果結果符合藥典要求，則可用。如果不可行，則調整后再進行驗證。

20.若無需都重新驗證，那么參照標準為05版藥典，又可以通過什么文件來更改為參照10版藥典？

答：請看上一題。

21.檢驗控制菌用培養基促生長能力的檢查，也需要對照培養基嗎？例如：大腸埃希菌用的BL增菌液。

答：是的。請看附錄“微生物限度檢查法”中的表2。

22、10版藥典增加貼膏劑的檢查，狗皮貼膏藥屬于貼膏劑嗎？

答：應該是的。請對照《中國藥典》一部附錄P8進行確定。

23、請問若試驗條件限制未能使用勻漿儀制備非規定滅菌制劑是否可采用溫熱（不超過45℃）的稀釋液？

答：如果能夠充分分散樣品，可以的。

24、請問若采用薄膜過濾法進行驗證，由于過濾難度大，是否可以每膜過濾相當于供試品0.1g，報告以結果乘以10？

答：驗證計數時可以的，驗證控制菌時檢驗總量應達到藥典要求，如果一張膜檢驗量達不到，可分幾個膜。

25、請問采用靜置分層取上清液薄膜過濾，是否需要加稀釋劑對照組？

答：個人觀點可以不用,但未經驗證。

26、供試品靜置分層取上清液進行試驗，靜置3~5分鐘，是否經過驗證供試品的本底菌不會沉到底部？

答：未經驗證。

27、培養基適用性檢查，抑制能力檢查用菌種是哪些？

答：控制菌的培養基適用性檢查,請看藥典“微生物限度檢查法”中表2，計數用培養基請看“計數培養基的適用性檢查”。

28、投料中有神曲提取物，限度應界定為多少？

答：不是藥材原粉投料，標準均按“不含藥材原粉的制劑”執行。

29、微生物限度檢查里有關經驗類的東西都必須經過驗證才可以使用,那么驗證的內容包括哪些數據應記錄，是否也應該有文件與記錄？

答：參照藥典，你是作什么樣的檢驗，就作什么樣的驗證，有驗證就應該有記錄。

30、比如10倍稀釋級菌落數為0，100倍稀釋級菌落數為2，按2005年版藥典應以低稀釋級菌落數報告為＜10，還是按最高平均菌落數乘以稀釋倍數報告為200個/g，是否理解正確？

答：按《中國藥典》2005年版報告應為＜10個/g（或ml），按《中國藥典》2010年版報告應為200cfu/g（或ml）。

31、計數方法的驗證：執行新版藥典是否就延長培養時間做方法驗證？

答：是。

32、平皿法中提到“每個稀釋級每種培養基至少檢驗2ml供試液”，是每皿注2ml還是每皿注1ml？如要做0.5ml或0.2ml，本級是否還需做1ml?

答：常規平皿法時每皿注1ml，做2個皿；培養基稀釋法（即每皿0.5ml或0.2ml）時，供試液總量也應是2ml，每1ml菌落數合計后，2ml的菌落數再平均；本級就不需做1ml了，但下一級就只做1ml/皿就行了。

33、在細菌霉菌計數檢查中，老師提到的每個稀釋級每種培養基至少檢驗2ml供試液，但2010版藥典上并沒有要求要這樣做，那應以哪個做法為準？

答：藥典中對平皿法的描述：平皿法“取供試液1ml，置直徑90mm 的無菌平皿中，注入15～20ml 溫度不超過45℃?的溶化的營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基，混勻，凝固，倒置培養。每稀釋級每種培養基至少制備2 個平板。”這里的描述是以常規平皿法進行描述的，所以“每稀釋級每種培養基至少制備2 個平板”，也就是2ml的量。對于培養基稀釋法，請看藥典供試液的制備中3. (6) ①。

34、10版藥典要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗量應增加20g或20ml，（其中10g或10ml用于陽性對照試驗）是否指20g或20ml樣品中10g或10ml直接用于沙門菌控制檢查，另10g或10ml加pH7.0的緩沖液100ml作為1：10的供試品溶液作為細菌，霉菌，酵母菌的檢驗嗎？還是指20g都用于沙門菌檢查？

答：20g都是用于沙門菌檢查。沙門菌的檢查法是：取3份200ml營養肉湯，其中2份分別加入10g或10ml樣品，取其中1份加入10~100cfu菌液作陽性對照。第3份加入10ml稀釋劑作陰性對照進行檢查，所以。細菌，霉菌，酵母菌檢驗的樣品不包括在這里。

35、沙門菌檢查為10g或10ml，為何一次檢查量又為20g或20ml？（P130）

答：其中10g（或10ml）是檢驗用的，另10g（或10ml）是用于陽性對照試驗的。請看上一題目解釋。

36、采用薄膜過濾法時，濾膜采用何種方法滅菌最好？

??答：據龙8娱乐官方网站經驗，最好采用一次性過濾器。如果用多次使用的過濾器，則濾膜用濕熱滅菌比較好，因為干熱滅菌后，濾膜較脆，試驗時不容易保證濾膜完整。

37、方法學驗證時，采用平皿法稀釋級計數，是否要做稀釋級對照組？

?答：稀釋級對照組？是指本底菌組嗎？如果是，那就要。因為要平行試驗，才能知道同一稀釋級的本底菌是多少。如果是指稀釋劑對照組，就不用，因為所用的稀釋劑是藥典規定的，是無毒性的稀釋劑。

38、方法驗證的培養基稀釋法驗證（樣品0.2ml）只做2個平皿，每個平皿的加菌量是多少？如果同步加0.2ml菌，其加菌量就達不到50~100cfu。

答：不管每皿加的供試液的量是多少，每皿加菌液的量都是1ml ,即都是50~100cfu。

39、平皿法（稀釋法）計數驗證時，取最低稀釋供試液如0.5ml和50~100cfu試驗菌，那50~100cfu的試驗菌是指50~100cfu還是50~100cfu∕0.5ml？龙8娱乐官方网站是要加1ml還是0.5ml的試驗菌？

答：平皿法（稀釋法）計數驗證時，每皿要加的菌液是50~100cfu，一般龙8娱乐官方网站配制的菌液濃度是50~100cfu/ml，所以就加1ml。如果你配制的菌液不是這個濃度，你可以折算，只要加的菌數是50~100cfu/皿就行了。

40、細菌霉菌方法驗證，同時做1ml，0.5ml，0.2ml供試品組及供試品驗證組時，菌液是否也按1ml，0.5ml，0.2ml分別加入？此時1ml，0.5ml，0.2ml供試品驗證組中的菌數能否也達到50~100cfu？

答：驗證時，不論是1ml，0.5ml，0.2ml的供試液，每皿的加菌量都是50~100cfu，即1ml（如果你配制的菌液濃度是50~100cfu/ml）。

41、培養基稀釋方法驗證，每皿0.2ml，加菌液0.2ml，那么0.2ml的菌液計數是否在50~100cfu∕0.2ml。

答：請看上一題的解釋。

42、微生物限度檢查霉菌、酵母菌要求不超過100?的情況下，這兩種菌是不是要分開來檢，用不同培養基檢測？目前只用玫瑰紅鈉瓊脂培養基檢測這兩種菌，有沒有必要修改？

??答：按藥典規定，一般品種是用玫瑰紅鈉瓊脂培養基檢測這兩種菌；含蜂蜜、王漿的液體制劑，用玫瑰紅鈉瓊脂培養基測定霉菌數，用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基測定酵母菌數，合并計數。

43、測表面微生物時，直接接觸藥品與間接接觸藥品的限度（≤25）一致，是否有不妥，如果有不同意見，可否提供其計數方法？另外，如果檢測到菌落數超過100以上，那么報告規則的菌數也是取兩位有效數字嗎？

答：“測表面微生物”??？這應該是藥包材的檢測標準吧？由于龙8娱乐官方网站尚未開展這項業務，所以對其標準情況不了解，但既然已經成為標準，就肯定有其合理性，如有不同意見，可向標準制訂部門反映，并提出你認為合理的解決辦法。微生物的報告規則一般都是取兩位有效數字。

44、內包裝材料PVC硬片，鋁箔等樣品的微生物檢驗（限度）方法？

答：是藥包材的檢驗？應該有相應的檢驗方法吧！

45、控制菌檢查，大腸埃希菌IMViC試驗，結果顯示未檢出，有沒有硬性規定必須要進一步鑒定？

答：對于大腸埃希菌檢查，IMViC試驗已經是鑒定試驗了，如果IMViC試驗結果顯示未檢出，那么就可以報告未檢出大腸埃希菌。

46、菌數報告按兩位有效數字報告，是按數字修約方法進行數據修約，還是只用保留兩位有效數字，如菌數為364報告菌數為360，還是370；若菌數為3670報告菌數應為多少？

答：修約原則是4舍6入5留雙。即菌數為364報告菌數為360；若菌數為3670報告菌數應為3700；如果是3650，則報告菌數應為3600。

47、在日常檢驗中控制菌檢驗方法通過驗證的控制菌檢驗可否不做陽性對照？理解：在驗證時已做過控制菌+?供試液，驗證時供試液對控制菌無抑菌性，若只是做控制菌（不加供試液）則在培養基適用性時已證明培養基的質量，那么每次試驗做陽性對照的意義是什么？或者陽性對照試驗怎么做？

??答：從理論上來說是可以的，驗證試驗實際上就是檢驗時的陽性對照試驗。但藥典要求控制菌檢查時必需同時從陽性對照和陰性對照，這應該是考慮到檢驗過程的檢驗系統的誤差吧。本人認為，生產廠家對自己的產品在經驗證后，檢驗時如果每天同一產品批量很大，可以只做一個陽性對照，但對于藥檢所則必須每批都做，因為對于同一品種，不同廠家其生產工藝不盡相同，在檢驗過程中對被檢微生物的干擾也不同。因此，藥檢所應每批都做。

48、取樣量藥典要求“從2個以上最小包裝單位中抽取供試品”，是否包括2個？

答：包括。

49?、請問藥廠自行做的微生物方法驗證是否需要經過藥檢所的審核？若產品更改為輔料，重新做方法驗證，是否需要到藥檢所備案或需要藥檢所審核？

??答：藥廠自行做的微生物方法驗證不需要經過藥檢所的審核。同樣，重新驗證后也不需要。但如果你的檢品需要報注冊檢驗，則你必需提供你的整個驗證資料，藥檢所將根據情況對你的方法進行確認，看方法是否可行。

50、是否每次做培養基適用性都必須與對照培養基進行比較？如果第一批培養基與對照培養基比較回收率為90%，那么第二批培養基與第一批培養基比較回收率為80%，則折算為第二批培養基與對照培養基比較回收率為72%，之后購買的培養基與前一批比較，而不用每次培養基適用性都與對照培養基比較，這樣可不可行？

??答：請按藥典要求做，至于內部控制則要自己掌握。但你要保證第一批培養基在你用于與第二、第三批比較時，質量保持其與對照培養基比較時一樣，因為隨著時間的推移，培養基的質量肯定有所下降。

 

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