一、實驗目的和內容
目的：學習乳酸發酵和制作乳酸菌飲料的方法，了解乳酸菌的生長特性。
內容：1．從新鮮酸乳中進行乳酸菌的分離純化。
2．乳酸發酵及檢測。
3．乳酸菌飲料制作。
4．自制乳酸質量品嘗。
二、實驗材料和用具
嗜熱乳酸鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、保加利亞乳酸桿菌(Lactobacillus bulgaricus)，乳酸菌種也可以從市場銷售的各種新鮮酸乳或酸乳飲料中分離；
BCG牛乳培養基、乳酸菌培養基、脫脂乳試管(見注)、脫脂乳粉或全脂乳粉、鮮牛奶、蔗糖、碳酸鈣；
恒溫水溶鍋、酸度計、高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、培養箱、酸乳瓶(200～280mL,)、培養皿、試管、300mL三角瓶。
三、操作步聚
(一)乳酸菌的分離純化
1．分離   取市售新鮮酸乳或泡制酸菜的酸液稀釋至10-5，，取其中的10-4、10-52個稀釋度的稀釋液各0.1～0.2mL，分別接入BCG 牛乳培養基瓊脂平板上，用無菌涂布器依次涂布；或者直接用接種環蘸取原液平板劃線分離，置40℃培養48h，如出現圓形稍扁平的黃色菌落及其周圍培養基變為黃色者初步定為乳酸菌。
2．鑒別   選取乳酸菌典型菌落轉至脫脂乳試管中，40℃培養8～24h若牛乳出現凝固，無氣泡，呈酸性，涂片鏡檢細胞桿狀或鏈球狀(兩種形狀的菌種均分別選入)，革蘭氏染色呈陽性，則可將其連續傳代4～6次，最終選擇出在3～6h能凝固的牛乳管，作菌種待用。
(二)乳酸發酵及檢測
1．發酵   在無菌操作下將分離的1株乳酸菌接種于裝有300mL  乳酸菌培養液的500mL三角瓶中，40～42℃靜止培養。
2．檢測   為了便于測定乳酸發酵情況，實驗分2組。一組在接種培養后，每6～8h取樣分析，測定pH值。另一組在接種培養24h后每瓶加入CaCO3 3g(以防止發酵液過酸使菌種死亡)，每6～8h取樣，測定乳酸含量(方法見注)，記錄測定結果。
(三)乳酸菌飲料的制作
1．將脫脂乳和水以1:7～10(WW)的比例，同時加入5%--6%蔗糖，充分混合，于80～85℃滅菌10～5min，然后冷卻至35～40℃，作為制作飲料的培養基質。
2．將純種嗜熱乳酸鏈球菌、保加利亞乳酸桿菌及兩種菌的等量混合菌液作為發酵劑，均以2%～5%的接種量分別接入以上培養基質中即為飲料發酵液，亦可以市售鮮酸乳為發酵劑。接種后搖勻，分裝到已滅菌的酸乳瓶中，每一種菌的飲料發酵液重復分裝3～5瓶，隨后將瓶蓋擰緊密封。
3． 把接種后的酸乳瓶置于40--42℃恒溫箱中培養3～4h。培養時注意觀察，在出現凝乳后停止培養。然后轉入4～5℃的低溫下冷藏24h以上。經此后熟階段，達到酸乳酸度適中(pH4～4.5)，凝塊均勻致密，無乳清析出，無氣泡，獲得較好的口感和特有風味。
4．以品嘗為標準評定酸乳質量 采用乳酸球菌和乳酸桿菌等量混合發酵的酸乳與單菌株發酵的酸乳相比較，前者的香味和口感更佳。品嘗時若出現異味，表明酸乳污染了雜菌。比較項目按表22-1。
四、注意事項
1. 采用BCG牛乳培養基瓊脂平板篩選乳酸菌時，注意挑取典型特征的黃色菌落，結合鏡檢觀察，有利高效分離篩選乳酸菌。
2．制作乳酸菌飲料，應選用優良的乳酸菌，采用乳酸球菌與乳酸桿菌等量混合發酵，使其具有獨特風味和良好口感。
3．牛乳的消毒應掌握適宜溫度和時間，防止長時間采用過高溫度消毒而破壞酸乳風味。
4．作為衛生合格標準還應按衛生部規定進行檢測，如大腸菌群檢測等。經品嘗和檢驗，合格的酸乳應在4℃條件下冷藏，可保存6～7d。
五、實驗報告
1．乳酸發酵過程、檢測結果及結果分析。
表22—1  乳酸菌單菌及混合菌發酵的酸乳品評結果
2．將發酵的酸乳品評結果記錄于表22—1中；
六、問題和思考
1、發酵酸乳為什么能引起凝乳？
2．為什么采用乳酸菌混合發酵的酸乳比單菌發酵的酸乳口感和風味更佳？
3．試設計一個從市售鮮酸乳中分離純化乳酸菌的制作乳酸菌飲料的程序。
注：
（一）脫脂乳試管
直接選用脫脂乳液或按脫脂乳粉與5%蔗糖水為1：10的比例配制，裝量以試管的1/3為宜，115℃滅菌15min .
（二）乳酸檢測方法
1．定性測定  取酸乳上清液的10mL于試管中，加入10% H2SO4 1mL，再加2% KMnO4 1mL，此時乳酸轉化為乙醛，把事先在含氨的硝酸溶液中浸泡的濾紙條搭在試管口上，微火加熱試管至沸，若濾紙變黑，則說明有乳酸存在，這里因為加熱使乙醛揮發的結果。
2．定量測定:
(1)測定方法:取稀釋10倍的酸乳上清液0.2mL，加至3mL pH9.0的緩沖液中，再加入0.2mL NAD溶液，混勻后測定OD340nm值為A1，然后加入0.02mL L(+)LDH，0.02 D(一)LDH，25℃保溫lh后測定OD340nm值為A2。同時用蒸餾水代替酸乳上清液作對照，測定步驟及條件完全相同，測出的相應值為Bl和B2。
（3）測定乳酸試劑的配制(見附錄)
3．酸乳的檢查指標  ①感觀指標：酸乳凝塊均勻細膩，色澤均勻無氣泡，有乳酸特有的悅味；②合格的理化指標：如脂肪≥3%，乳總干物質≥11.5%，蔗糖≥5.00%，酸度70～110Tº，Hg﹤0.01×10-6mg/mL等；③無致病菌，大腸菌群≤40個/100m L。
     
   

 

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