革蘭氏染色法

　　革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫師Gram創立。 

　　細菌先經堿性染料結晶染色，而經碘液媒染后，用酒精脫色，在一定條件下有的細菌此色不被脫去，有的可被脫去，??因此可把細菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽性菌（G+），后者為革蘭氏陰性菌（G—）。為觀察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅等進行復染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。有芽胞的桿菌和絕大多數和球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應；弧菌，螺旋體和大多數致病性的無芽胞桿菌都呈現負反應。

　　革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在化學組成和生理性質上有很多差別，染色反應不一樣。現在一般認為革蘭氏陽性菌體內含有特殊的核蛋白質鎂鹽與多糖的復合物，它與碘和結晶紫的復合物結合很牢，不易脫色，陰性菌復合?物結合程度底，吸附染料差，易脫色，這是染色反應的主要依據。 　　另外，陽性菌菌體等電點較陰性菌為低，在相同PH條件下進行染色，陽性菌吸附堿性染料很多，因此不易脫去，陰性菌則相反。所以染色時的條件要嚴格控制。例如，在強堿的條件下進行染色，兩類菌吸附堿性染料都多，都可呈正反應；PH很低時，則可都呈負反應。此外，兩類菌的細胞壁等對結晶紫—碘復合物的通透性也不一致，陽性菌透性小，故不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色。所以脫色時間，脫色方法也應嚴格控制。 　　革蘭氏染色?法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：

　　１）涂片固定。

　　２）草酸銨結晶紫染1分鐘。

　　３）自來水沖洗。

　　４）加碘液覆蓋涂面染1分鐘。

　　５）水洗，用吸水紙吸去水分。

　　６）加95%酒精數滴，并輕輕搖動進行脫色，30秒后水洗，吸去水分。

　　７）蕃紅梁色液（稀）染10秒鐘后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。

· 染色的結果:革蘭氏陽性菌，呈紫色；革蘭氏陰性菌，呈紅色。

下面是革蘭氏陽性桿菌和革蘭氏陰性桿菌：

· 革蘭氏染色過程中應注意的事項：

1）接種環接的菌不能太多，防止涂片太厚，不易脫色。

2）干燥（固定）：要在酒精燈的高處微微加熱，使?水分蒸發，切勿緊?靠火焰或加熱時間過長，防止菌體燒焦變形。

· 固定的目的：

a.殺死微生物，固定細胞結構；

b.保證菌體能更牢固粘附在載玻片上，防止標本被水沖洗掉；

c.改變染料對細胞的通透性，因為死的原生質比活的原生質易于脫色。

（2）．細菌結構

A、基本結構及功能

①細胞壁：細胞最外層。賦予細胞特定形態，保護細胞不受高壓和機械壓力的破壞。化學成分主要由粘肽（共有的）、蛋白質、脂類等組成。

②細胞膜作為滲透屏障，選擇性滲透細菌體內外物質的交換，維持新陳代謝、??參與呼吸作用。化學成分基本相同，由磷脂質、蛋白?質、碳水化合物組成。

③細胞漿（質）：是細胞膜包圍著的部分，是?細菌的基礎物質、內在環境，是細菌合成蛋白質、核酸的場所。基礎成分是水、蛋白質、核酸、脂類

④極核：位于細胞漿內，控制著細胞新陳代謝、生長繁殖、細菌的遺傳變異信息。 

B、特殊結構及功能

①莢膜：某些在細胞壁外包一層粘性物質，相對穩定的附于細胞壁外。具有保護、能源供應的作用。化學組成主要是多?糖或多肽類。

②鞭毛：菌體內長出的細長絲狀物細菌的運動器官。化學成分主要是蛋白質，少量糖類、脂類。

③纖毛：比鞭毛更細、短、直、硬，數量更多的毛發狀細物。 

功能：獲得營養。由蛋白質亞單位組成。

④芽孢：某些細菌在生活的一定階段，能在體內形成一個特殊的休眠體。

l 孢子的形成

活菌

核細胞聚集（在惡劣生長條件下）

核周圍有一層厚臂形成（孢子）

細胞分解，孢子釋出

孢子釋出

適宜生長條件下，孢子的膜脹破，新細胞形成。

l 殺滅芽孢條件：121℃ 、20分鐘

        &nb??sp;          160℃ 、2小時

判斷滅菌是否徹底，一般以芽孢是否被殺滅作為標準。

附：芽孢染色法

染液的配制：

a．石碳酸品紅溶液：

堿性品紅    &??nbsp;        &??nbsp;   0.3 g

95%體積分數的乙醇       10ml

50g/L酚水溶液 &nb??sp;      &nb??sp;   90 ml

將品紅溶解于乙醇中，然后與酚溶液混合

b．堿性美蘭溶液

c．95%乙醇

染色方法：

a．將有芽孢的細菌涂片，干燥后熱固定；

b．加石炭酸品紅溶液，弱火加熱，冒熱氣約5分鐘，冷卻后水洗；

c．用95%的乙醇脫色2分鐘，水洗；

d．用堿性美蘭溶液復染0.5分鐘，水洗；

e．待干，鏡檢。

結果觀察：芽孢呈紅色，菌體呈藍色。

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