1適用范圍：適用于定量分析LGG純菌種及LGG乳制品中的LGG菌數量。

2定義：LGG是一種鼠李糖乳桿菌菌株(ATCC 53103)，革蘭氏陽性，過氧化物酶陰性，棒狀，鏈形，不發酵乳糖，對萬古霉素有抗性。

3原理：樣品經稀釋劑稀釋后均質，然后按10倍的稀釋倍數接?種到選擇性瓊脂培養基中，厭氧培養，計數所?有的菌落，結果以cuf/g計。

注：培養過程中，所有萬古霉素抗性的菌株都會生長（比如所有的鼠李糖乳桿菌，干酪乳桿菌，胚芽乳桿菌等）。但是，由于LGG不發酵乳糖，所??以可以很容易地區分開來。進一步分析鑒定則可采用基因的方法。

4儀器和玻璃器皿

只要規格可以滿足要求，采??用一次性或可重復使用的儀器均可。除了微生物實驗室所常用的儀器外，下列儀器是必需的：

烘箱；    高壓殺菌鍋；   培養?箱（37℃??±1℃）；      水浴（44-47℃）；

混合器（Peristaltic-type）；帶有無菌塑料袋； ??      &??nbsp;天平。

5培養基和試劑

5.1 稀釋液準備

蛋白棟1.0g；    &nb?sp;   氯化鈉8.5g；      去離子水1000mL。

若需要，可緩慢加熱至完??全溶解。將溶液分至一些瓶子中，然后在高壓殺菌鍋中進行殺菌（121℃±1℃，15分鐘）。殺??菌后，溶液pH7.0±0.2。

每個瓶子均可在常溫下貯存半年。

5.2 培養基

5.2.1 MRS瓊脂培養基：適用于純LGG菌種檢測。高壓殺菌后pH6.4±0.2,4-6℃條件下可貯存6個月。

5.2.2 MRS-萬古霉素瓊脂培養基（MRS-V）：適用于LGG菌種與普通酸奶菌種混合后的檢測。萬古霉素50mg/L, 可以在高壓殺菌前加入，也可以作為無菌濾液加入瓊脂中。

5.2.3 MRSL肉湯培養基（檢測乳糖發酵特性）

分別溶解于5-10mL乙醇中，然后加入肉湯中。取5mL試樣，高壓殺菌（121℃±1℃，15分鐘）后作測試用。殺菌后，溶液pH7.2±0.2。

6步驟

6.1 樣品制備

樣品制備前，先放置于室溫下1-2小時，以使其溫度與室溫相同。稱取10g樣品于無菌塑料袋中，加入90ml無菌蛋白胨-氯化鈉水溶液。將塑料袋放入混合器中混合60秒，以確保懸浮液均勻一致。這是第一個稀釋10倍的樣液，該溶??液必須繼續按10倍的倍數進行稀釋，且必須在15分鐘內將各樣液接種到培養皿中。

6.2 在選擇性瓊脂培養基中接種

選擇合適的瓊脂培養基：純菌種用MRS瓊脂培養基，混合菌種用MRS-萬古霉素瓊脂培養基。取1mL（傾倒法，即Pour-plate method）或0.1mL（涂抹法，即spread-plate method）每一稀釋度的樣液分別接種到兩個培養皿中，瓊脂的溫度?應為44-47℃，然后于厭氧條件下進行培養（37±1℃，72±6小時）。

6.3 菌落計數

計數那些L??GG菌落在10-300之間的培養皿。LGG菌落特征：光滑、大、白色、圓形或橢圓形、邊緣清晰。

6.4 確認實驗

為??了進一步確認菌落是否為LGG，可從菌落中挑取一些純菌種，進行顯微鏡觀察和乳糖發酵實驗（MRSL肉湯）。做乳糖發酵實驗時，將挑取的純菌種接種到肉湯培養基后，有氧培養（37±1℃，1-2天）。由于LGG不發酵乳糖，故肉湯應是紫色的（未變色）。而若是能夠利用乳糖的微生物，則肉湯變為黃色。實驗時，利用純LGG菌種和任一能夠利用乳糖的其它菌種進行對照實驗。

7結果?      ?    以每克樣品中LGG的菌落數表示，即cfu/g。

8注意事項：

1）、制備培養基，滅菌前可將萬古霉素加到MRS-A培養基中混均，按照培養基標簽上使用說明進行滅菌；

2）、檢樣前需將樣品在室溫下放置1-2小時，使其溫度與室溫相同，稱取樣品時應將包含LGG益生菌的部分????接入稀釋液中，混勻進行接種；

3）、根據樣品特性，接種稀釋倍數可選擇10-4和10-5，每個稀釋度分別接種兩個平皿；

4）?、樣品制備完畢，將各樣液接種到培養皿，傾倒溫度為44-47℃培養基，整個??操作過程必須在15分鐘內完成，同時做瓊脂空白試驗；

5）、待瓊脂凝固后，翻轉平皿放入厭氧罐，再放入厭氧測試條??，然后放入產氣袋，產氣袋放入后應立即將蓋蓋嚴，避免產氣袋在空氣中暴露時間過長；

6）、檢樣放入厭氧罐后在規定的培養條件下進行培養，并隨時觀察厭氧測試條顏色變化情況（無氧為白色，有氧時為粉色），保證培養條件完全達到無氧狀態；放入測試條時注意不要靠壁??，使其處于自然狀態。（一般在放入培養箱?后3-5小時后觀察，如測試條顏色發生變化，應再放入產氣袋重新進行測試）。

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