操作步驟

樣品處理:

  冷凍樣品應在45℃以下不超過15 min或在2℃～8℃不超過18 h解凍。若不能及時檢驗，應放于-15℃左右保存；

  非冷凍而易腐的樣品應盡可能及時檢驗。若不能及時檢驗，應置于2℃～8℃冰箱保存，在24 h內檢驗。

樣品制備

  以無菌操作取樣品25 g（mL），加入PBS 225 mL，用旋轉刀片式均質器以8000 r/min～10000 r/min均質1 min～2 min，或拍擊式均質器拍擊2 min。如無均質器，則將樣品放入無菌乳缽中磨碎，然后稱取25 g（mL）置合適的容器中，加225 mL PBS，充分振蕩混勻。制成1:10的樣品勻液。

增菌

  取1：10的樣品勻液10 mL（液體樣品可以選擇原液），加入90 mL胰酪胨大豆多粘菌素肉湯中，于30 ℃±1 ℃培養24 h±2 h。

分離

  取胰酪胨大豆多粘菌素增菌液劃線接種于MYP瓊脂平板上。于30 ℃±1 ℃培養24 h～48 h。觀察平板上生長的菌落。在MYP瓊脂平板上，典型菌落為灰白色至微粉紅色，周圍有白色至淡粉紅色沉淀環。

純培養

  從每個平板選取至少5個典型或可疑菌落，劃線接種于營養瓊脂平板做純培養，30 ℃±1 ℃培養24 h±2 h，進行確證實驗。營養瓊脂平板上，典型菌落在為灰白色，偶有黃綠色，不?透明，表面粗糙似毛玻璃狀或融蠟狀，邊緣常呈擴??展狀，直徑為4 mm～10 mm；

樣品的稀釋

     吸取1：10的樣品勻液1 mL加到裝有9 mL PBS的稀釋管中，充分混勻制成1：100的樣品勻液。據對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。

平板計數

  選擇2～3個適宜的連續稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度分別吸取0.1mL接種到MYP瓊脂平板上，每稀釋度接種兩個MYP瓊脂平板。用無菌L棒涂布整個平板，注意不要觸及平板邊緣。使用前，如MYP瓊脂平板表面有水珠，可放在25℃ ～ 50℃的培養箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。

  涂布后，將平板置于30 ℃±1 ℃培養24 h±2 h后（原標準為36 ℃±1 ℃培養12 h～20 h） ，選取具有15個～150個典型或可疑蠟樣芽胞桿菌菌落的平板，進行計數。并計算同一稀釋度兩個平板的平均菌落數。?如果菌落不典型，可繼續培養18 h～24 h再計數。

  計數后，從每個平板選取至少5個已計數的典型或可疑菌落，如果一個平板上少于5個典型或可疑菌落，則取所有典型或可疑菌落，分別劃線接種于營養瓊脂平板， 30 ℃±1 ℃培養24 h±2 h，進行確證實驗。

&nb?sp; 根據確證實驗確定為蠟樣芽胞桿菌的菌落數，按比例計算出該平板上蠟樣芽胞桿菌菌落數，然后計算同一稀釋度兩個平板的平均蠟樣芽胞桿菌數，再乘其稀釋倍數，再乘以10，即得每g（mL）樣品中蠟樣芽胞桿菌數并作出報告。

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