一、實驗目的和內容
目的：了解霉菌形態，掌握微生物載玻片濕室培養方法。
內容：1．霉菌載玻片濕室培養。
2．曲霉、青霉、根霉、毛霉形態觀察。
3．根霉假根的觀察。
二、實驗材料和用具
產黃青霉(Penicfillium chrysogenum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黑根霉(Rhizopus nigrians)、總狀毛霉(Mucor racemosus)等斜面菌種。
半固體PDA培養基、乳酸苯酚固定液、棉藍染色液、20%甘油;
透明膠帶、剪刀、培養皿、載玻片、口形玻棒擱架、蓋玻片、圓形濾紙片、細口滴管、鑷子、顯微鏡、接種環。
三、操作步驟
(一)霉菌的載玻片濕室培養
可4人合作，每人制作一霉菌的載玻片。
1．準備濕室   在培養皿底鋪一張圓形濾紙片，其上放一“冂”形載玻片擱架，在擱梁上放一塊載玻片和兩塊蓋玻片，蓋上皿蓋，外用紙包扎，經12lC濕熱滅菌30min后，置60℃烘箱中烘干，備用。
2．接種   用接種環挑取少量待觀察的霉菌孢子至濕室內的載玻片上，每張載玻片可接同一菌種的孢子兩處。接種時只要將帶菌的接種環在載玻片上輕輕碰幾下即可(務必記住接種的位置)。
3．加培養基   用無菌細口滴管吸取少量融化約60℃的培養基，滴加到載玻片的接種處，培養基應滴得圓而薄，其直徑約為0.5cm(滴加量一般以l/2小滴為宜)。
4．加蓋玻片   在培養基未徹底凝固前．用無菌鑷子將皿內蓋玻片蓋在瓊脂塊薄層上，用鑷子輕壓，使蓋玻片和載玻片間的距離相當接近，但不能壓扁，否則不透氣。
5．倒保濕劑   每皿倒大約3mL 20%的無菌甘油，使皿內的濾紙完全潤濕，以保持皿內濕度，皿蓋上注明菌名、組別和接種日期。此為制成的載玻片濕室，置28℃恒溫培養3～5d。
(二)黑根霉假根的培養
將融化的PDA培養基，冷卻至50℃倒入無菌平皿，其量約為平皿高度的l/2。冷凝后，用接種環沾取根霉孢子，在平板表面劃線接種。然后將平皿倒置，在皿蓋內放一無菌載玻片，于28℃培養2～3d后，可見根霉的氣生菌絲倒掛成胡須狀，有許多菌絲與載玻片接觸，并在載玻片上分化出假根和匍匐菌絲等結構（圖13—1）。
(三)鏡檢觀察
1．濕室培養霉菌鏡檢載玻片   從培養16～20h開始，通過連續觀察，可了解孢子的萌發、菌絲體的生長分化和子實體的形成過程。將濕室內的載玻片取出，直接置于低倍鏡和高倍鏡下觀察曲霉、青霉、毛霉、根霉等霉菌的形態，重點觀察菌絲是否分隔，曲霉和青霉的分生孢子形成特點，曲霉的足細胞，根霉和毛霉的孢子囊和孢囊孢子。繪圖。
2．粘片觀察   取一滴棉藍染色液置于載玻片中央，取一段透明膠帶，打開霉菌平板培養物，粘取菌體，粘面朝下，放在染液上。鏡檢。
3．假根觀察   將培養根霉假根的平皿打開，取出皿蓋內的載玻片標本，在附著菌絲體的一面蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察。只要用低倍鏡就能觀察到假根及從根節上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和兩個假根間的匍匐菌絲，觀察時注意調節焦距以看清各種構造。
4．制成永久裝片   把觀察到霉菌形態較清晰，完整的片子，制成標本作較長期保存。制備方法是，輕輕揭去蓋玻片，如果載玻片上有瓊脂，仔細挑去，然后滴加少量乳酸苯酚固定液，蓋上清潔蓋玻片，在蓋玻片四周滴加樹膠封固。
四、注意事項
載玻片濕室培養時，蓋玻片不能緊貼載玻片，要彼此有極小縫隙，一是為了通氣；二是使各部分結構平行排列，易于觀察。
五、實驗報告
(一)繪制鏡檢形態圖
1．毛霉和根霉形態圖，示各部。
2．青霉和曲霉形態圖，示各部
（二）載玻片觀察記錄
各菌種的載玻片標本觀察結果：
菌種 菌絲體
（氣生菌絲、營養菌絲的粗細、色澤、菌絲有隔或無隔等） 無性孢子特征（孢子梗的分化特征，孢子著生特征等） 其他特征結構
（有無假根、足細胞匍匐菌絲、囊軸等）
       
六、問題和思考
1．什么叫載玻片濕室培養?它適用于觀察怎樣的微生物，有何優點?
2．濕室培養時為何用20%甘油作保濕劑?
3．本實驗中觀察假根的設計原理是什么?此設計還適合于培養哪類菌。
 
   

 

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