一、實驗目的和內容
目的：辨認放線菌的營養菌絲、氣生菌絲、孢子絲、孢子的形態；學習放線菌的觀察方法。
內容：用水封計法、玻璃紙法、印片法觀察放線菌的形態特征。
二、實驗材料和用具
  細黃鏈霉菌(streptomycs micuoflavus)又稱5406的培養平皿，棘孢小單孢菌(Micromonospora echinospora)的玻璃紙培養平皿。
0.1%美藍染色液、石炭酸復紅染色液；
蓋玻片、載玻片、鑷子、接種環、顯微鏡、涂布器、玻璃紙、打孔器。
三、操作步驟
(一)觀察自然生長狀態的放線菌
用鑷子小心取出用插片法培養的5406菌培養皿中的一張蓋玻片，將其背面附著的菌絲體擦凈。然后將長有菌的一面向上放在潔凈的載玻片上，用低倍鏡、高倍鏡觀察。找出3類菌絲及其分生孢子，并繪圖。注意放線菌的基內菌絲、氣生菌絲的粗細和色澤差異。
(二)水封片觀察
取一滴美藍染色液置于載玻片中央，將用搭片法培養棘孢小單孢菌培養皿中的蓋玻片取出，并將有菌面朝下，放在載玻片上，浸在染色液中，制成水封片，用高倍鏡觀察其單個分生孢子及其基內菌絲，并繪圖。
(三)玻璃紙法的鏡檢觀察
l．直接玻璃紙觀察   分別用5406和棘孢小單孢菌的玻璃紙制片觀察。制片時，于載玻片上放一小滴蒸餾水，將含菌玻璃紙片小心剪下一小塊，移至載玻片上，并使有菌面向上。在玻璃紙與載玻片間不能有氣泡，以免影響觀察。將制片于顯微鏡下觀察，先用低倍鏡觀察菌的立體生長狀況，再用高倍鏡仔細觀察。注意區分5406菌的基內菌絲、氣生菌絲和彎曲狀或螺旋狀的孢子絲。觀察棘孢小單孢菌時注意把視野調暗，其基內菌絲纖細發亮，其單個分生孢子發暗，直接生長在基內菌絲長出的小梗上。繪圖。
2．印片染色法觀察   用鑷子取潔凈載玻片并微微加熱，然后用這微熱載玻片蓋在長有5406或棘孢小單孢菌的平皿上，輕輕壓一下，注意將載玻片垂直放下和取出，以防載玻片水平移動而破壞放線菌的自然形態。反轉有印痕的載玻片微微加熱固定．用石炭酸復紅染色l min，水洗，晾干。用油鏡觀察。繪圖。注意比較兩種菌的形態特征有何不同。
四、注意事項
1．培養放線菌中要注意，放線菌的生長速度較慢，培養期較長，在操作中應特別注意無菌操作，嚴防雜菌污染。
2．玻璃紙法培養接種時注意玻璃紙與平板瓊脂培養基間不宜有氣泡，以免影響其表面放線菌的生長，
3．不同觀察方法中嚴格按要求進行，注意菌體的上下位置。
五、實驗報告
1．繪圖 玻璃紙法、水封片法、印片法及自然生長狀態下觀察的放線菌形態。
2．試比較5406菌與棘孢小單孢菌特征的異同。
六、問題和思考
1．在高倍鏡或油鏡下如何區分放線菌的基內菌絲和氣生菌絲?
2．用插片法和搭片法如何制備放線菌標本，其主要優點是什么?可否用此法觀察其他微生物?為什么?
3．以玻璃紙覆蓋法培養和觀察放線菌有何優點?試用此法設計一個觀察青霉菌形態的實驗。
注：
(一)插片法和搭片法培養放線菌
1．插片法
(1)制平板、接種：用冷卻至約50℃的高氏1號瓊脂培養基倒平板(每皿約20mL)，可用兩種方法接菌：1、先接種后插片：冷凝后用接種環挑取少量斜面上的5406菌孢子，用平板培養基的一半面積作來回劃線接種(接種量可適當加大)；2、先插片后接種：用平板培養基的另一半面積進行。
(2)插片及培養：用無菌鑷子取無菌蓋玻片，在已接種平板上以45°角斜插入培養基內，插人深度約占蓋玻片1/2長度(圖11-1A)。同時，在另一半未經接種的部位以同樣方式插入數塊蓋玻片，然后接種少量5406菌孢子至蓋玻片一側的基部，且僅接種于其中央位置約占蓋玻片長度的一半左右，以免菌絲蔓延至蓋玻片的另一側。將插片平板倒置于28℃，培養3～7d。
2．搭片法
 (1)開槽及接種：用無菌打孔器在凝固后的平板培養基上打洞數個，并將棘孢小單孢菌孢子劃線接種至洞內邊緣。
(2)搭片及培養：在接種后的洞面上放一無菌蓋玻片，平板倒置于28℃，培養3～7d（圖11—1B）。
(二)玻璃紙法固體培養5406菌和棘孢小單孢菌
1．玻璃紙滅菌   將玻璃紙剪成比培養皿直徑略小的片狀，將濾紙剪成培養皿大小的圓形紙片并稍潤濕，然后把 濾紙和玻璃紙交互重疊地放在培養皿中，借濾紙將玻璃紙隔開。然后進行濕熱滅菌，備用。
2．制平板及鋪玻璃紙   取冷凝后的高氏1號瓊脂培養基，用無菌鑷子將預先滅菌的塊狀玻璃紙平鋪至平板培養表面，鋪玻璃紙時可用無菌涂布器將玻璃紙與培養基之間的氣泡除去。
3．涂布菌液及培養 取0.l mL的孢子懸液涂布在鋪有玻璃紙的平板培養基表面。接種平板倒置于28℃，培養 5～7d。
    
   

 

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