4.2.6 陽性誘變劑的配制
根據所選擇的誘變??劑的種類和劑量用適當的溶媒配制陽性對照品(見附錄B、附錄C??)。
??注:培養基成分或試劑除特殊說明外至少應是化學純,無誘變性。避免重復高溫處理,選擇適當保存?溫度和期限。
4.3 10%S9混合液的制備
4.3.1 S9輔助因子的配制
4.3.1.1 鎂鉀溶液
 ??; 氯化鎂1.9 g和氯??化鉀6.15 g加蒸餾水溶解至100 mL。
4.3.1.2 磷酸鹽緩沖液(0.2mol/L)(pH7.4)
 ??; 磷酸氫二鈉(28.4 g/L) 440 mL
磷酸二氫鈉(27.6 g/L) 60 mL
調pH至7.4,0.103 MPa滅菌20 min或濾菌。
4.3.1.3 輔酶-Ⅱ(氧化型)溶液
無菌條件下稱取輔酶Ⅱ,用無菌蒸餾水溶解配制成溶液(0.025mol/L)?,??現用現配。
4.3.1.4 葡萄糖-6-磷酸鈉鹽溶液
&nb?sp; 無菌條件下稱取葡萄糖-6-磷酸鈉鹽,用無菌蒸餾水溶解配制成溶液(0.05 mol/L),現用現配。
4.3.2 大鼠肝S9組分的誘導和配制
選健康雄性?成年SD或Wistar大鼠,體重150g~200g,周齡約5周?~6周。將多氯聯苯
(Aroclorl254)溶于玉米油中,濃度為200 g/L。,按??500mg/kg體重無菌操作一次腹腔注射,5d后處死
動物,處死前禁食12h。
也可采用苯巴比妥鈉和β-萘黃酮聯合誘導的方法進??行制備,經口灌胃給予大鼠苯巴比妥?鈉和β萘
黃酮,劑量均為80 mg/kg,連續3d,禁食16 h后斷頭處死動物。其他操作同多氯聯苯誘導。
處死動物后取出肝?臟,稱重后用新鮮冰冷的氯化鉀溶液(0.15 mol/L)連續沖洗肝臟數次,以
便除去能抑制微粒體酶活性的血紅蛋白。每克肝(濕重)加氯化鉀溶液0.1mol/L)3 mL,連同燒杯
移入冰浴中,用無菌剪刀剪碎肝臟?,在玻璃勻漿器(低于4000 r/min,1min~2 min)或組織勻漿器??(低
于20000 r/min,1min)中制成肝勻漿。以上操作需注意無菌和局部冷環境。
?? 將制成的肝勻漿在低溫(0℃~4℃)高速離心機??上以9000g離心10 min,吸m上清液為S9組分,
分裝于無菌冷凍管或安瓿中,每安瓿2 mL左右,用液氮或干冰速凍后置80℃低溫保存。
S9組分制成后,?經無菌檢查,測定蛋白含量(Lowry法),每毫升蛋白含量不超過40mg為宜,并經
間接致癌物(誘變劑)鑒定其生物活性合格后貯存于深低溫或冰凍干燥,保存期不超過1年。
4.3.3 10%S9混合液的制備
&nb??sp; 10%S9混合液一般由S9組分和輔助因子按1:9組成,也可將濃度配制??成30%(不同受試物所需
S9濃度不同),臨用時新鮮無菌配制,或過濾除菌。10%S9混合液10 mL配制如下:
磷酸鹽緩沖液 6.0mL
鎂鉀溶液 0.4mL
葡萄糖-6-磷酸鈉鹽溶液&n??bsp; &nb??sp; 1.0 mL
輔酶Ⅱ溶液 1.6 mL
肝S9組分 1.0 mL
混勻,置冰浴中待用。
用每平板0.5 mL S9混合液(含20μL~50μL S9)測定其??對已知陽性致癌物(誘變劑)的生物活性,
確定最適用量。也可按一般用量,即每平皿0.5 mL S9混合液。