培養基和試劑
A.1磷酸鹽緩沖液(PBS)
A.1.1成分 磷酸二氫鉀 |
34.0 g |
蒸餾水 |
500.0 mL |
A.1.2制法
貯存液:稱取34.0 g的磷酸??二氫鉀溶于500 mL蒸餾水中,用大約175 mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至7.2,用蒸餾水稀釋??至1000 mL后貯存于冰箱。
稀釋液:取貯存液1.25 mL,用蒸餾水稀釋至1000 mL,分裝于適宜容器中,121℃高??壓?滅菌15 min。
A.2甘露醇卵黃多黏菌素(MYP)瓊脂
A.2.1成分 蛋白胨 |
10.0 g |
牛肉粉 |
1.0 g |
D-甘露醇 |
10.0 g |
氯化鈉 |
10.0 g |
瓊脂粉 |
12.0~15.0 g |
0.2 %酚紅溶液 |
13.0 mL |
50 %卵黃液 |
50.0 mL |
多黏菌素B |
100,000 IU |
蒸餾水 |
950.0 mL |
A.2.2制法
將A.2.1前五種成分加入于950mL蒸餾水中,加熱溶解,校正pH至7.3±0.1,加入酚紅溶液。分裝,每瓶95mL,121℃高壓滅菌15 min。臨用時加熱溶化瓊脂,冷卻至50℃,每?瓶加入50%卵黃液5 mL和濃度為10000 IU的多黏菌素B溶液1 mL,混勻后傾注平板。
A.2.2.1 50%卵黃液
取鮮雞蛋,用硬刷將蛋殼??徹底洗凈,瀝干,于70%酒??精溶液中浸泡30 min。用無菌操作取出卵黃,加入等量滅菌生理鹽水,混勻后備用。
A.2.2.2多黏菌素B溶液
在50 mL滅菌蒸餾水中溶解500000 IU的無菌硫酸鹽多黏菌素B。
A.3胰酪胨大豆多黏菌素肉湯
A.3.1成分 胰酪胨(或酪蛋白胨) |
17.0g |
植物蛋白胨(或大豆蛋白胨) |
3.0 g |
氯化鈉 |
5.0 g |
無水磷酸氫二鉀 |
2.5 g |
葡萄糖 |
2.5 g |
多黏菌素B |
100 IU/mL |
蒸餾水 |
1000.0 mL |
A.3.2制法
將A.3.1前五種成分加入于蒸餾水中,加熱溶解,校正pH至7.3±0.2,121℃高壓滅菌15 min。臨用時加入多黏菌素??B溶液混勻即可。多黏菌素B溶液制法同附錄A.2.2.2。
A.4營養瓊脂
A.4.1成分 蛋白胨 |
10.0 g |
牛肉膏 |
5.0 g |
氯化鈉 |
5.0 g |
瓊脂粉 |
12.0~15.0 g |
蒸餾水 |
1 000.0 mL |
A.4.2制法
將A.4.1所述成分溶解于蒸餾水內,校??正pH至7.2±0.2,加熱使瓊脂溶化。121℃高壓滅菌15? min,備用。
A.5過氧化氫溶液
A.5.1試劑
3%過氧化氫溶液:臨用時配制,用H2O2配制。
A.5.2試驗方法
??用細玻璃棒或一次性接種針挑取單個菌落,置于潔凈試管內,滴加3%過氧化氫溶液2mL,??觀察結果。
A.5.3結果于30s內發生氣泡者為陽性,不發生氣泡者為陰性。
A.6動力培養基
A.6.1成分 胰酪胨(或酪蛋白胨) |
10.0 g |
酵母粉 |
2.5 g |
葡萄糖 |
5.0 g |
無水磷酸氫二鈉 |
2.5 g |
瓊脂粉 |
3.0~5.0g |
蒸餾水 |
1 000.0 mL |
A.6.2制法
將A.?6.1所述成分于蒸餾水,校正pH至7.?2±0.2,加熱溶解。分裝每管2 mL~3 mL。115℃高壓滅菌20min,備用。
A.6.3試驗方法
用接種針挑取培養物穿刺接種于動力培養基中,30℃±1℃培養48 h±2 h。蠟樣芽胞桿菌應沿穿刺線呈擴散生長?,而蕈狀芽胞桿菌常常呈絨毛狀生長,形成蜂巢狀擴散。動力試驗也可用懸滴法檢查。蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌通常運動極為活潑,而炭疽桿菌則不運動。
A.7硝酸鹽肉湯
A.7.1成分 蛋白胨 |
5.0 g |
硝酸鉀 |
0.2 g |
蒸餾水 |
1 000.0 mL |
A.7.2制法
將A.7.1所述成分溶解于蒸餾水。校正pH至7.4,分?裝每管5 mL,121℃高壓滅菌15 min。
A.7.3硝酸鹽還原試劑
甲液:將對氨基苯磺酸0.8 g溶解于2.5 mol/L乙酸溶液100 mL中。
乙液:將甲萘胺0.5 g溶解于2.5 mol/L乙酸溶液100 mL中。
A.7.4試驗方法
接種后在36℃±1??℃培養24 h~72 h。加甲液和乙液各1滴,觀察結果,陽性反應立即或數分鐘內顯紅色。如為陰性,可再加入鋅粉少許,如出現紅色,表示硝酸鹽未被還原,為陰性。反之,則表示硝酸鹽已被還原,為陽性。
A.8酪蛋白瓊脂
A.8.1成分 酪蛋白 |
10.0 g |
牛肉粉 |
3.0 g |
無水磷酸氫二鈉 |
2.0 g |
氯化鈉 |
5.0 g |
瓊脂粉 |
12.0~15.0 g |
蒸餾水 |
1 000.0 mL |
0.4 %溴麝香草酚藍溶液 |
12.5 mL |
A.8.2制法
除溴麝香草酚藍溶液外,將A.8.1所述各成分溶于蒸餾水中加熱溶解(酪蛋白不會溶解)。校正pH至7.4±0.2?,加入溴麝香草酚藍溶液,121℃高壓滅菌15 min后傾注平板。
A.8.3試驗方法
用接種環挑取可疑菌落,點種于酪蛋白瓊脂培養基上,36℃±1℃培養48 h±2h,陽性反應菌落周圍培養基應出現澄清透明區(表示產生酪蛋白酶)。陰性反應時應繼續培養?72 h再觀察。
A.9硫酸錳營養瓊脂培養基
A.9.1成分 胰蛋白胨 |
5.0 g |
葡萄糖 |
5.0 g |
酵母浸膏 |
5.0 g |
磷酸氫二鉀 |
4.0 g |
3.08%硫酸錳(MnSO4·H2O) |
1.0 mL |
瓊脂粉 |
12.0~15.0 g |
蒸餾水 |
1 000.0 mL |
A.9.2制法
將A.9.1所述成分溶解于蒸餾水。校正pH至7.2±0.2。121??℃高壓滅菌15 min,備用。
A.10 0.5%堿性復紅
A.10.1成分
堿性復紅0.5g
乙醇20.0 mL
蒸餾水80.0 mL
A.10.2制法
取堿性復紅0.5g溶解于20mL乙醇中,再用蒸餾水稀釋至100mL,濾紙過濾后儲存備用。
11動力培養基
A.11.1成分
蛋白胨10.0 g
牛肉浸粉3.0g
瓊脂4.0g
氯化鈉5.0g蒸餾水 |
1 000.0 mL |
A.11.2制法
將A.11.1所述成分溶解于蒸餾?水。校正pH至7??.2±0.2,分裝小試管,121℃高壓滅菌15 min,備用。
A.12糖發酵管
A.12.1成分 牛肉粉 |
5.0 g |
蛋白胨 |
10.0 g |
氯化鈉 |
3.0 g |
磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) |
2.0 g |
0.2 %溴麝香草酚藍溶液 |
12.0 mL |
蒸餾水 |
1 000.0 mL |
12.2制法
??A.12.2.1糖發酵管按A.12.1所述成分配好后,校正pH至7.2±0.2,按0.5 %加入葡萄糖,分裝于一個有倒置小管的小試管內,115℃高壓滅菌15 min。
A.12.2.2其他各種糖發酵管可按A.12.1所述成分配好后,分裝每瓶100 mL,115℃高壓滅菌15 min。另將各種糖類分別配好10 %溶液,同時115℃高壓滅菌1?5 min。將5 mL糖溶液加入于100 mL培養基內,以無菌操作分裝小試管。
注:蔗糖不純,加熱后會自行水解者,應采用過濾法除菌。
A.12.3試驗方法
挑取可疑菌落接種于葡萄糖發酵管中,厭氧條件下36℃±1℃??培養24 h±2 h。培養基由紅色變為黃色者表明該菌在厭氧條件下能發酵葡萄糖。
A.13 V-P培養基
A.13.1成分 磷酸氫二鉀 |
5.0 g |
蛋白胨 |
7.0 g |
葡萄糖 |
5.0 g |
氯化鈉 |
5.0 g |
蒸餾水 |
1 000.0 mL |
A.13.2制法
??將A.13.1所述成分溶解于蒸餾水。校正pH至7.0±0.2,??分裝每管1 mL。115℃高壓滅菌20min,備用。
A.13.3試驗方法
用營養瓊脂培養物接種于本培養基中,36℃±1℃培養48 h~72 h。加入6 %α-萘酚-??乙醇溶液0.5 mL和40 %氫氧化鉀溶液0.2 mL,充分振搖試管,觀察結果,陽性反應立即或于數分鐘內出現紅色。如為陰性,應放在36℃±1℃培養4 h再觀察。
A.14胰酪胨大豆羊血(TSSB)瓊脂
A.14.1成分 胰酪胨(或酪蛋白胨) |
15.0g |
植物蛋白胨(或大豆蛋白胨) |
5.0 g |
氯化鈉 |
5.0 g |
無水磷酸氫二鉀 |
2.5 g |
葡萄糖 |
2.5 g |
瓊脂粉 |
12.0~15.0 g |
蒸餾水 |
1 000.0 mL |
A.14.2制法
將A.14.1所述各成分于蒸餾水中加熱溶解。校正pH至7.2±0.2,??分裝每瓶100 mL。121℃高壓滅菌15 min。水浴中冷卻至45℃~50℃,毎100mL加入5~10mL無菌脫纖維羊血,混勻后傾注??平板。
A.15溶菌酶營養肉湯
A.15.1成分 牛肉粉 |
3.0 g |
蛋白胨 |
5.0 g |
蒸餾水 |
990.0 mL |
0.1%溶菌酶溶液 |
10.0 mL |
A.15.2制法
除溶菌酶溶液外,將A.15.1所述成分溶解于蒸餾水。校正pH至6.8±0.1,分裝每瓶99 mL。121℃高壓滅菌15 min。每瓶加入0.1 %溶菌酶溶液1 mL,混勻后分裝滅菌試管,每管2.5 mL。0.1%溶菌酶溶液配制:在65 mL滅菌的0.1 mol/L鹽酸中加入0.1 g溶菌酶,隔水煮沸20 min溶解后,再用滅菌的0.1?? mol/L鹽酸稀釋至100 mL。或者稱取0.1 g溶菌酶溶于100 mL的無菌蒸餾水后,用孔徑為0.45 μm硝酸纖維膜過濾。使用前測試是否無菌。
A.15.3試驗方法
用接種環取純菌懸液一環,接種于溶菌酶肉湯中,36℃±1℃培養24 h。蠟樣芽胞桿菌在本培養基(含0.001%溶菌酶)中能生長。如出現陰性反應,應繼續培養24?? h。
A.16西蒙氏檸檬酸鹽培養基
A.16.1成分 氯化鈉 |
5.0 g |
硫酸鎂(MgSO4·7 H2O) |
0.2 g |
磷酸二氫氨 |
1.0 g |
磷酸氫二鉀 |
1.0 g |
檸檬酸鈉 |
1.0 g |
瓊脂粉 |
12.0~15.0 g |
蒸餾水 |
1000.0 mL |
0.2 %溴麝香草酚藍溶液 |
40.0 mL |
A.16.2制法
除溴麝香草??酚藍溶液和瓊脂外,將A.16.1所述各成分溶解于1000.0 mL蒸餾水內,校正pH至6.8,再加瓊脂,加熱溶化。然后加入溴麝香草酚藍溶液,混合均勻后分裝試管,121℃高壓滅菌15 min。制成斜面。
A.16.3試驗方法
挑取少量瓊脂培養物接種于西蒙氏檸檬酸培養基,36??????????????????????????℃±1℃培養4d。每天觀察結果,陽性者斜面上有菌落生長,培養基從綠色轉為藍色。
A.17明膠培養基
A.17.1成分
蛋白胨5.0 g
牛肉粉3.0 g
明膠120.0 g
蒸餾水1 000.0 mL
A.17.2制法
將A.17?.1所述成分混合,置流動蒸汽滅菌器內,加熱溶解,校正pH至7.4~?7.6,過濾。分裝試管,121℃高壓滅菌10 min,備用。
A.17.3試驗方法
挑取可疑菌落接種于明膠培養基,3?6℃±1℃培養24h±2h,取出,2℃~8℃放置30 min,取出,觀察明膠液化情況。 ??
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