流程

4.2操作步驟

4.2.1樣品處理

冷凍樣品?應在45 ℃以下不超過15 ??min或在2 ℃～5 ℃不超過18 h解凍，若不能及時檢驗，應放于-10℃~ -20℃保存；非冷凍而易腐的樣品應盡可能及時檢驗，若不能及時檢驗，應置于2 ℃～5 ℃冰箱保存，24 h內檢驗。

4.2.2樣品制備

稱取樣品25 g，放入盛有225 mL PBS或生理鹽水的無菌均質杯內，用旋轉刀片式??均質器以8000 r/min～10000 r/min均質1 min～2 min，或放入盛有225 mL PBS或生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1 min～2 min。若樣品?為液態，吸取25 mL 樣品至盛有225 mL PBS或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內可預置適當數量的無菌玻璃珠)中，振蕩混勻，作為1:10的樣品勻液。

4.2.3樣品的稀釋

吸取4.2.2中1:10的樣品勻液1 mL加到裝有9mL PBS或生理鹽水的稀釋管中，充分混勻制成1:100的樣品勻液。跟據對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十?倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管?或吸頭。

4.2.4樣品接種

根據對樣品污染狀況的估計，選擇2個～3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 接種量分?別移入三塊MYP瓊脂平板，然后用無菌L棒涂布整個平板，注意不要觸及平板邊緣。使用前，如MYP瓊脂平板表面有水珠，可放在25 ℃～50 ℃的培養箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。

4.2.5分離、培養

4.2.5.1 分離

在通常情況下，涂布后，將平板靜置10 min。如樣液不易吸收，可將平板放在培養箱30 ℃±1℃培養1 h，等樣品勻液吸收后翻轉平皿，倒置于培養箱，30 ℃±1 ℃培養24 h±2 h。如果菌落不典型，可繼續培養24 h±2 h再觀察。在MYP瓊脂平板上，典型菌落為微粉紅色(表示不發酵甘露醇)，周圍有白色至淡粉紅色??沉淀環（表示產卵磷脂酶）。

4.2.5.2純培養

從每個平板（符合4.4.1.1要求的平板）中挑取至少5個典型菌落（小于5個全選），分別劃線接種于營養瓊脂平板??做純培養，30 ℃±1 ℃培養24 h±2 h，進行確證實驗。在營養瓊脂平板上，典型菌落為灰白色，偶有黃綠色，不透明，表面粗糙似毛玻璃狀或融蠟狀，邊緣常呈擴展狀，直徑為4 mm～10 mm。

4.3確定鑒定

4.3.1染色鏡檢

挑取純培養的單個菌落，革蘭氏染色鏡?檢。蠟樣芽胞桿菌為革蘭氏陽性芽胞桿菌，大??小為（1μm～1.3μm）×（3μm～5μm），芽胞呈橢圓形位于菌體中央或偏端，不膨大于菌體，菌體兩端較平整，多呈短鏈或長鏈狀排列。

4.3.2生化鑒定

4.3.2.1 概述

挑取純培養的單個菌落，進行過氧化氫酶試驗、動力試驗、硝酸鹽還原試驗、酪蛋白分解試驗、溶菌酶耐性試驗、V-P試驗、?葡萄??糖利用(厭氧)試驗、根狀生長試驗、溶血試驗、蛋白質毒素結晶試驗。蠟樣芽胞桿菌生化特征與其他芽胞桿菌的區別見表1。

4.3.2.2動力試驗

用接種針挑取培養物穿刺接種于動力培養基中，30℃培養24h。有動力的蠟樣芽胞桿菌應沿穿刺線呈擴散生長，而蕈狀芽孢桿菌常呈“絨毛狀”生長。也可??用懸滴法檢查。?

4.3.2.3溶血試驗

挑取純培養的單個可疑菌落接種于TSSB瓊脂平板上，30 ℃±1 ℃培養?24 h±2 h。蠟樣芽胞桿菌菌落為淺灰色，不透明，似白色毛玻璃狀，有草綠色溶血環或完全溶血環。蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌呈現弱的溶血現象，而多數炭疽芽胞桿菌為不溶血，巨大芽胞桿菌為不溶血。

4.3.2.4根狀生長試驗

挑取單個可疑菌落按間隔2cm～3cm左右距離劃平行?直線于經室溫干燥1d～2d的營養瓊脂平板上，30 ℃±1 ℃培養24 h～48h，不能超過72h。用蠟樣芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌標準株作為對照進行同步試驗。蕈狀芽胞桿菌呈根狀生長的特征。蠟樣芽胞桿菌菌株呈粗糙山谷狀生長的特征。

4.3.2.5溶菌酶耐性試驗

用接種環取純菌懸液一環，接種于溶菌酶肉湯中，36 ℃±1 ℃培養24 h。蠟樣芽胞桿菌在??本培養基（含0.001%溶菌酶）中能生長。如出現陰性反應，應繼續培養24 h。巨大芽胞桿菌不生長。

4.3.2.6蛋白質毒素結晶試驗

挑取純培養的單個可疑菌落接種于硫酸錳營養瓊脂平板上，30 ℃±1 ℃培養24 h±2 h，并于室溫放置3 d～4 d，挑取培養物少許于載玻片上，滴加蒸餾水混勻并涂成薄膜。經自然干燥，微火固定后??，加甲醇作用30 s后傾去，再通過火焰干燥，于載玻片上滴滿0.5%堿性復紅，放火焰上加熱（微見蒸氣，勿使染液沸騰)持續1 min～2 mi?n，移去火焰，再更換染色液再次加溫染色30 s，傾去染液用潔凈自來水徹底清洗、晾干后鏡檢。觀察有無游離芽胞（淺紅色）和染成深紅色的菱形蛋白結晶體。如發現游離芽胞形成的不豐富，應再將培養物置室溫2 d～3 d后進行檢查。除蘇云金芽胞桿菌外，其他芽胞桿菌不產生蛋白結晶體。

4.3.3生化分型(選做項目)

根據對檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、淀粉水??解、V-P試驗反應、明膠液化試驗，將蠟樣芽胞桿菌分成不同生化型別，見表2。

樣品接種

取3個適宜連續稀釋度的樣品勻液（液?體樣品可包括原液），接種于10 mL胰酪胨大豆多黏菌素肉湯中，每一稀釋度接種3管，每管接種1 mL（如果接種量需要超過1 mL，則用雙??料胰酪胨大豆多黏菌素肉湯）。于30 ℃±1 ℃培養48 h±2 h。

5.2.5培養

用接種環從各管中分別移取1環，劃線接種到MYP瓊脂平板上，30 ℃±1 ℃培養24 h±2 h。如果菌落不典型，可繼??續培養24 h±2 h再觀察。

5.2.6確定鑒定

從每個平板選取5個典型菌落（小于5個全選），?劃線接種于營養瓊脂平板做純培養，30 ℃±1 ℃培養24 h±2 h，進行確證實驗，見4.3。

5.3結果與報告

根據證實為蠟樣芽胞桿菌陽性的試管管數，查MPN檢索表（見附錄B）?，報告每g（mL）樣??品中蠟樣芽胞桿菌的最可能數，以MPN/g（mL）表示。

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