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電鏡樣品制備方法



錄入時間:2012-6-6 16:53:05 來源:醫學教育網

    用電子顯微鏡觀察的樣品也要經過認真細致的處理,以至于今天出現了一門非常有用的技術科學—電子顯微鏡學。電子顯微鏡觀察樣品的方法很多,基本上可以分為透射型和掃描型兩類。前者是電子流通過觀察樣品而形成圖象;后者則是用來觀察微生物的表面細節,分辨率大約在7納米左右。待觀察的樣品則必須進行相當復雜的處理,而且有些處理方法是和用光學顯微鏡觀察時很不相同的,因為在進行電子顯微鏡觀察時受到一些特殊限制。首先,由于樣品處于高真空環境中,樣品必須盡可能保持原狀,所以微生物樣品要進行固定和脫水處理;第二,要使電子束全部透過樣品,所以樣品必須盡可能薄;第三,為了便于觀察,圖象的反差要大,光學顯微鏡是靠光的吸收差異來達到,而電子顯微鏡則靠電子散射程度,決定電子散射程度的是元素的質量和厚度,為此常用重金屬處理,例如金、鉑等處理。

  投射電子顯微鏡的觀察樣品的主要制備方法是:

  1、投影法

  在真空條件下,用電子散射能力強的重金屬原子來噴鍍樣品表面,這樣在樣品和沒有噴鍍的區域形成了較強的反差,而沒有噴鍍的部分成了樣品的投影,根據投影龙8娱乐官方网站可以了解樣品的立體形狀、高度,通常用這種方法來觀察細菌的鞭毛或病毒的顆粒。

  2、負染法

  因為這種方法是將樣品的背景染色以突顯樣品,所以稱為負染。一般是用電子密度高,本身不會顯示任何結構,又和樣品不起反應的物質,例如磷鎢酸的鈉鹽將樣品包圍,同時染色劑還會投入觀察對象的內部,這樣,既能顯示外形,又可在一定程度上反應樣品的內部結構。用這種方法可以觀察細菌細胞、病毒等。

  3、超薄切片法

  這是最常用的方法,因為可以觀察細胞或其它樣品內部的細微結構。通常是要按照一定程序對樣品進行固定,脫水,然后包埋在樹脂中作為支持物,用超薄切片機切成極薄的切片。因為只有在20~100納米厚度的切片用投射電子顯微鏡才能觀察,所以一般細菌樣品,一個細胞要分割成10片到50片。

  4、冰凍蝕刻法

  所謂冰凍蝕刻,是把樣品放在-196℃的液態氮中迅速冷凍,然后加溫到-100℃,使樣品變得非常脆弱易碎,再用預先也冷卻到-196℃的非常鋒利的玻璃斷口切割經冷凍的樣品,這樣使樣品在最容易斷裂的部位斷開(如果是微生物細胞,則多半是沿內膜中部),然后讓樣品放在真空條件下升華掉斷口處的冰,最后用重金屬噴鍍該斷口表面,即可用電子顯微鏡觀察其結構。用這種制備方法的優點是可以避免在固定、脫水和包埋過程中造成細胞結構的人為改變而形成的假象。

  和投射電子顯微鏡是靠透過物體的電子成像不同,掃描電子顯微鏡的成像是靠觀察物體表面發射的電子。掃描電子顯微鏡是用聚焦得很細的電子束在樣品表面掃描。電子激發樣品表面的原子放電,釋放出微細的電子簇(二次電子),用靈敏的檢測裝置可以捕獲它們,然后通過類似電視機的原理將樣品圖象呈現出來。二次電子對檢測器的作用取決于樣品表面的性質,當電子激發樣品表面突起部位時,會有大量二次電子進入檢測器,而表面凹陷處則只有少量二次電子進入,所以可以顯出反差突出、明暗清晰的三維圖象。而且它的成像焦深較長,圖象的立體感強,和肉眼所見差別不大。制備掃描電子顯微鏡的樣品也先要經過固定、脫水等處理,以免在真空條件下變形失真,為了獲得較多的二次電子,表面要噴涂重金屬和碳原子。

 

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