一. 目的

    掌握芽孢桿菌屬常見種的分離、鑒定方法和技術。將土壤樣品中分離的芽孢桿菌屬未 知種鑒定到屬。

二．原理

    芽孢桿菌能產生芽孢， 在沸水中加熱不會失去生理活性， 但是不能產生芽孢的細菌會失 去活性，因而得到芽孢菌屬，經過進一步的分離及生理生化鑒定得到枯草芽孢桿菌。

三．材料和器皿

顯微鏡 培養皿 試管 三角瓶 燒杯 移液管 涂布棒 載玻片 接種環 接種針 試管架 滅菌鍋 培養箱 培養基：牛肉膏蛋白胨培養基 半固定培養基 淀粉培養基 v.p.實驗培養基 孔雀綠溶液 番紅復染液 NaOH 溶液等

四．操作步驟

 菌種的分離和純化

（1）土樣的采集：取土壤表層 5-10cm 下的肥土 100g 左右，把采得的土壤放入紙袋帶 回實驗室分離。

（2）平板的制備：溶化三角瓶中的牛肉湯蛋白胨培養基，以每皿 20ml 左右倒 6 個平 板。

（3）稀釋分離法：稱取肥土 5g 放入含有 45ml 水的三角瓶中，搖動片刻，然后將此瓶 用小火加熱至懸濁液沸騰， 維持 15min。 而后靜止 5min， 吸取上層液 0.1ml 加入到含有 4.5ml 無菌水的試管中，制成 1:100 濃度的懸液，然后分別吸取 10-2 和 10-3 土壤懸濁液各 0.2ml 滴加到上述牛肉湯蛋白胨培養基平板上（每種稀釋度 2 皿） ，用涂布棒均勻涂布，并將培養 基倒置于 37℃恒溫培養 1-2 天。

（4）挑菌及純化：從上述分離的平板上分別挑取 2 個單菌落中部分菌體，在牛肉膏蛋 白胨培養基上劃線純化，經菌落特征的觀察和鏡檢，確定是芽孢桿菌屬純種后，從中選擇一 株轉接于牛肉膏蛋白胨斜面上，置 37℃培養 1-2 天后備用。 （菌體應呈桿狀，具芽孢，寬度 一致；菌落顏色、形狀、質地、透明度等均一致）

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