實驗目的
1.學習并初步掌握革蘭氏染色法。
2.了解革蘭氏染色法的原理及其在細菌分類鑒定中的重要性。
實驗內容
1.制作細菌染色裝片。
2.分別對單菌和混菌進行革蘭氏染色法操作。
實驗原理
用于生物染色的染料主要有堿性染料、 酸性染料和中性染料三大類。 堿性染料的離子帶正電荷,能和帶負電荷的物質結合。因細菌蛋白質等電點較低,當它生長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷,所以通常采用堿性染料(如美藍、結晶紫、堿性復紅或孔雀綠等)使其著色。酸性染料的離子帶負電荷,能與帶正電荷的物質結合。當細菌分解糖類產酸使培養基 pH下降時,細菌所帶正電荷增加,因此易被伊紅、酸性復紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結合物又稱復合染料,如伊紅美藍、伊紅天青等。
革蘭氏染色法是 1884年由丹麥病理學家 C.Gram所創立的。 革蘭氏染色法可將所有的細菌區分為革蘭氏陽性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G—)兩大類,是細菌學上最常用的鑒別染色法。
該染色法所以能將細菌分為 G+菌和 G—菌,是由這兩類菌的細胞壁結構和成分的不同所決定的。G—菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質,而且肽聚糖層較薄、交聯度低,故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質,增加了細胞壁的通透性,使初染的結晶紫和碘的復合物易于滲出,結果細菌就被脫色, 再經蕃紅復染后就成紅色。G+ 菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯度高, 類脂質含量少,經脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小,通透性降低,因此細菌仍保留初染時的顏色。
實驗器材
培養 12-16h的枯草桿菌(Bacillus subtilis),培養 24 小時的大腸桿菌(Escherichia coli)
結晶紫、盧哥氏碘液、95%酒精、蕃紅、液體石蠟、擦鏡液
載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡等。
實驗步驟
一、單菌的革蘭氏染色:
分別取枯草桿菌、大腸桿菌進行革蘭氏染色。
1.制片:
(1) 涂菌:取干凈載玻片一塊,在載玻片上加一滴生理鹽水,按無菌操作法取菌涂片,注意取菌不要太多。
(2) 干燥:讓涂片自然晾干或者在酒精燈火焰上方文火烘干。
(3)固定:手執玻片一端,讓菌膜朝上,通過火焰 2-3次固定(以不燙手為宜)
2.染色
(1) 初染:滴加結晶紫(以剛好將菌膜覆蓋為宜)染色 1~2min,水洗。
(2) 媒染:用碘液沖去殘水,并用碘液覆蓋約 1min,水洗。
(3) 脫色:用濾紙吸去玻片上的殘水,將玻片傾斜,在白色背景下,用滴管流加 95%的乙醇脫色,直至流出的乙醇無紫色時,立即水洗。
(4) 復染:用番紅液復染約 2min,水洗。
3.鏡檢:干燥后,用油鏡觀察。菌體被染成藍紫色的是革蘭氏陽性菌,被染成紅色的為革蘭氏陰性菌。
二、混菌的革蘭氏染色:
按上述方法,在同一載玻片上,以大腸桿菌和枯草芽孢桿菌作混和涂片、染色、鏡檢進行比較。
實驗結果及討論
1.實驗結果
列表簡述 2株細菌的染色觀察結果(說明各菌的形狀、顏色和革蘭氏染色反應),分別繪制單菌及混菌的染色結果。
2.討論
針對實驗原理、步驟、現象進行討論。
實驗作業
1.你認為哪些環節會影響革蘭氏染色結果的正確性?其中最關鍵的環節是什么?
2.進行革蘭氏染色時,為什么特別強調菌齡不能太老,用老齡細菌染色會出現什么問題?
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