實驗目的

    掌握細菌的鞭毛染色技術。 

實驗內容 

    學習細菌的鞭毛染色法。 

實驗原理 

    細菌的鞭毛極細，直徑一般為 10—20nm，只有用電子顯微鏡才能觀察到。但是，如采用特殊的染色法，則在普通光學顯微鏡下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染劑處理，讓它沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然后再進行染色。常用的媒染劑由丹寧酸和氯化高鐵或鉀明礬等配制而成。現推薦以下兩種染色法。 

實驗器材 

培養 12-16h的水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae），粘質賽氏桿菌（Serratia marcescens）或假單細胞菌（Pseudomonas sp.）斜面菌種。 

銀染色液、Leifson染色液、香柏油、二甲苯。 

載玻片、擦鏡紙、吸水紙、記號筆、玻片擱架、鑷子、接種環，顯微鏡。 

實驗步驟 

1．鍍銀法染色 

(1) 清洗玻片 選擇光滑無裂痕的玻片，最好選用新的。為了避免玻片相互重疊，應將玻片插在專用金屬架上， 然后將玻片置洗衣粉過濾液中 （洗衣粉煮沸后用濾紙過濾， 以除去粗顆粒）， 煮沸 20min。 

取出稍冷后用自來水沖洗、晾干，再放入濃洗液中浸泡 5—6天，使用前取出玻片，用自來水沖去殘酸，再用蒸餾水洗。將水瀝干后，放入 95%乙醇中脫水。 

(2) 菌液的制備及制片：菌齡較老的細菌容易失落鞭毛，所以在染色前應將待染細菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培養基斜面上（培養基表面濕潤，斜面基部含有冷凝水）連續移接 3-5 代，以增強細菌的運動力。最后一代菌種放恒溫箱中培養 12—16h。然后，用接種環挑取斜面與冷凝水交接處的菌液數環，移至盛有 1—2mL無菌水的試管中，使菌液呈輕度混濁。將該試管放在 37℃恒溫箱中靜置10min （放置時間不宜太長，否則鞭毛會脫落），讓幼齡菌的鞭毛松展開。然后，吸取少量菌液滴在潔凈玻片的一端，立即將玻片傾斜，使菌液緩慢地流向另一端，用吸水紙吸去多余的菌液。涂片放空氣中自然干燥。 

    用于鞭毛染色的菌體也可用半固體培養基培養。方法是將 0.3-0.4%的瓊脂肉膏培養基熔化后倒入無菌平皿中，待凝固后在平板中央點接活化了 3-4代的細菌，恒溫培養 12-16h后，取擴散菌落的邊緣制作涂片。 

(3) 染色 

① 滴加 A液，染 4—6min。 

② 用蒸餾水充分洗凈 A液。 

③ 用 B 液沖去殘水，再加 B 液于玻片上，在酒精燈火焰上加熱至冒氣，約維持 0.5—1min（加熱時應隨時補充蒸發掉的染料，不可使玻片出現干涸區）。 

④ 用蒸餾水洗，自然干燥。

(4) 鏡檢：先低倍，再高倍，最后用油鏡檢查。 

    結果：菌體呈深褐色，鞭毛呈淺褐色。 

2．改良 Leifson染色法 

(1) 清洗玻片法同 1。 

(2) 配制染料  染料配好后要過濾 15-20次后染色效果才好。 

(3) 菌液的制備及涂片 

① 菌液的制備同 1。 

② 用記號筆在潔凈的玻片上劃分 3—4個相等的區域。 

③ 放 1滴菌液于第一個小區的一端，將玻片傾斜，讓菌液流向另一端，并用濾紙吸去多余的菌液。 

④ 干燥  在空氣中自然干燥。 

(4) 染色 

① 加染色液于第一區，使染料覆蓋涂片。隔數分鐘后再將染料加入第二區，依此類推 （相隔時間可自行決定），其目的是確定最合適的染色時間，而且節約材料。 

② 水洗：在沒有傾去染料的情況下，就用蒸餾水輕輕地沖去染料，否則會增加背景的沉淀。 

③ 干燥：自然干燥。 

(5) 鏡檢  先低倍觀察，再高倍觀察，最后再用油鏡觀察，觀察時要多找一些視野，不要企圖在 1-2個視野中就能看到細菌的鞭毛。 

    結果：菌體和鞭毛均染成紅色。 

注意事項 

1．鍍銀法染色比較容易掌握，但染色液必須每次現配現用，不能存放，比較麻煩。 

2．Leifson染色法受菌種、菌齡和室溫等因素的影響，且染色液須經 15-20次過濾，要掌握好染色條件必須經過一些摸索。 

3．細菌鞭毛極細，很易脫落，在整個操作過程中，必須仔細小心，以防鞭毛脫落。 

4．染色用玻片干凈無油污是鞭毛染色成功的先決條件。 

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