培養

指把培養材料放在培養室（有光照、溫度條件）里，使之生長，分裂、分化形成愈傷組織或進一步分化成再生植株的過程。

（一）培養方法

1．固體培養法

即用瓊脂固化培養基來培養植物材料的方法。是現在最常用的方法。該法設備簡單，易行。但養分分布不均，生長速度不均衡。并常有褐化中毒現象發生。

2．液體培養法

即用不加固化劑的液體培養基培養植物材料的方法。由于液體中氧氣含量較少，常需要通過攪動或振動培養液的方法以確保氧氣的供給，采用往復式搖床或旋轉式搖床進行培養，其速度一般為50～100轉／min，這種定期浸沒的方法，既能使培養基均一，又能保證氧氣的供給。

（二）培養步驟

1．初代培養

   即接種某種外植體后，最初的幾代培養。初代培養旨在獲得無菌材料和無性繁殖系。初代培養時，常用誘導或分化培養基，即培養基中含有較多的細胞分裂素和少量的生長素。初代培養建立的無性繁殖系包括莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等。根據初代培養時發育的方向可分為：

（1）頂芽和腋芽的發育

采用外源的細胞分裂素，可促使具有頂芽或沒有腋芽的休眠側芽啟動生長。形成一個微型的多枝多芽的小灌木叢狀的結構。在幾個月內可以將這種叢生苗的一個枝條轉接繼代，重復芽－苗增殖的培養，從而迅速獲得多數的嫩莖。然后將一部份嫩莖轉移到生根培養基上，就能得到可種植到土壤中去的完整的小植株。一些木本植物和少數草本植物可以通過這種方式來進行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。這種繁殖方式也稱作微型扦插，它不經過發生愈傷組織而再生，是最能使無性系后代保持原品種特性的一種繁殖方式。

適宜這種再生繁殖的植物，在采樣時，只能采用頂芽、側芽或帶有芽的莖切段，其它如種子萌發后取枝條也可以。

莖尖培養可看作是這方面較為特殊的一種方式。它采用極其幼嫩的頂芽的莖尖分生組織作為外植體進行接種。在實際操作中。采用包括莖尖分生組織在內的一些組織來培養，這是為了操作方便以及容易成活。

用靠培養定芽得到的培養物一般是莖節較長，有直立向上的莖梢，擴繁時主要用切割莖段法，如香石竹、矮牽牛、菊花等。但特殊情況下也會生出不定芽，形成芽叢。

   （2）不定芽的發育

在培養中由外植體產生不定芽,通常首先要經脫分化過程,形成愈傷組織的細胞。然后，經再分化，即由這些分生組織形成器官原基，它在構成器官的縱軸上表現出單向的極性（這與胚狀體不同）。多數情況下它先形成芽，后形成根。

另一種方式是從器官中直接產生不定芽，有些植物具有從各個器官上長出不定芽的能力如矮牽牛、福祿考、懸鉤子等。當在試管培養的條件下，培養基中提供了營養，特別是連續不斷植物激素的供應，使植物形成不定芽的能力被大大地激發起來。許多種類的外植體表面幾乎全部為不定芽所覆蓋。許多常規方法不能無性繁殖的種類，在試管條件下卻能較容易地產生不定芽而再生，如柏科，松科，銀杏等一些植物。許多單子葉植物儲藏器官能強烈地發生不定芽，用百合鱗片的切塊就可大量形成不定鱗莖。

在不定芽培養時，也常用誘導或分化培養基。用靠培養不定芽得到的培養物，一般采用芽叢進行繁殖，如非洲菊、草莓等。

（3）體細胞胚狀體的發生與發育

    體細胞胚狀體類似于合子胚但又有所不同，它也通過球形，心形，魚雷形和子葉形的胚胎發育時期，最終發育成小苗。但它是由體細胞發生的。胚狀體可以從愈傷組織表面發生，也可從外植體表面已分化的細胞產生，或從懸浮培養的細胞產生。

(4)初代培養外植體的褐變

外植體褐變是指在接種后，其表面開始變褐，有時甚至會使整個培養基變褐的現象。它的出現是由于植物組織中的多??酚氧化酶被激活，而使細胞的代謝發生變化所致。在褐變過程中，會產生醌類物質，它們多呈棕褐??色，當擴散到培養基后，就會抑制其他酶的活性，從而影響所接種外植體的培養。

褐變的主要原因如下：

（1）花卉品種：研究表明，在不同花卉品種間的褐變??現象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差異，因此有些花卉品種的外植體在接種后較易褐變，而有些花卉品種的外植體在接種后不易褐變。故在培養過程中應該有所選擇，對不同的品種分別進行處理。

（2）生理狀態：外植體的生理狀態不同，在接種后褐變程度也有所不同。一般來說，處于同期的植物材料褐變程度較淺，而從已經成年的植株采收的外植體，由于含醌類物質較多，因此褐變較為嚴重。一般來說，幼嫩的組織在接種后褐變程度并不明顯，而老熟的?組織在接種后褐變程度較為嚴重。

（3）培養基成分：濃度過高的無機鹽會使某些觀賞植物的褐變程度增加，此外，細胞分裂素的水平過高也會刺激某些花卉外植體的多酚氧化酶??的活性，從而使褐變現象加深。

（4）培養條件不當：例如光照過強、溫度過高、培養時間過長等，??均可使多酚氧化酶的?活性提高，從而加速被培養的外植體的褐變程度。

為了提高花卉組織培養的成苗率，必須對外植體的褐變現象加以控制。經過眾多研究者的努力，可以采用措施防止、減輕褐變現象??的發??生。

（1）選擇合適的外植體：一般來說，最好選擇生長處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現象明顯減輕。

（2）合適的培養條件：無機鹽成分、植物生長物質水平、適宜溫度、及時繼代培養均可以減輕材料的褐變現象。

（3）使用抗氧化劑：在培養基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減??輕很多外植體的褐變現象。另外使用0．1％～0．5％的活性炭對防止褐變也有較為明顯的效果。

（4）連續轉移：對容易褐變的材料可間隔12～24小時的培養后，再轉移到新的培養基上，這樣經過連續處理7～10天后，褐變現象便會得到控制或大為減輕。  

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