綠膿桿菌在自然界分布甚廣，空氣、水、土壤中均有存在。對人有致病力，?常引起人皮膚化膿感染，特別是燒??傷、燙傷、眼部疾病患者被感染后，常使病情惡化，并可引起敗血癥，因此，在化妝品衛生標準中規定不得檢出綠膿桿菌。

1 方法提要

根據??本菌生物學特征：革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽??性，能產生綠膿菌素。此外還能液化明膠，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在42℃條件下生長等，可與類似菌相區別。

2 培養基和試劑

2.1 SCDLP 液體培養基

見GB 7918.1-87《化妝品微生物標準檢驗方法 總則》。

2.2 十六烷三甲基溴化銨培養基

成分： 牛肉膏?                  3g

蛋白胨     &nb??sp;            10g

氯化鈉   &n??bsp;      &nb??sp;       5g

十六烷三甲基溴化銨         0.3g

瓊脂      &??nbsp; &n?bsp;              20g

蒸餾水  &nbs??p;                 1000ml

制法：除瓊脂外，將上述成分混合加熱溶解，調pH為7.4～7.6，加入瓊脂，115℃(10 1b)20min滅菌后，制成平板備用。

2.3 乙酰胺培養基

成分：乙酰胺         &nb?sp;      10.0g

氯化鈉   &n??bsp;                   5.0g

無水磷酸氫于鉀          &??nbsp;  1.39g

無水磷酸二氫鉀        &n??bsp;    0.73g

硫酸鎂(MgSO4·7H2O)    &n?bsp;       0.5g

酚紅            ?;           0.012g

瓊脂            ?  ?;            20g

蒸餾水  &?nbsp;                  1000ml

制法：除瓊脂和酚紅外，將其他成分加到蒸餾水中，加熱溶解，調pH為7.2，加入瓊脂、酚紅，121℃(15 1b)20min高壓滅菌后，制成平板備用。

2.4 綠膿菌色素測定用培養基

成分： 蛋白胨      &nb?sp;  &n??bsp;  20g

氯化鎂           &n??bsp; ?     1.4g

硫酸鉀 ??;        &??nbsp;         10g

瓊脂        &nbs??p;            18g

甘油(化學純)          &nb??sp;  10g

蒸餾水          ?;      1000ml

制法：將蛋白胨、氯化鎂和硫酸鉀加到蒸餾水中，加溫使溶解，調pH至7.4，加入瓊脂和甘油，加熱溶解，分裝于試管內，115℃(10 1b)20min高壓滅菌后，制成斜面備用。

2.5 明膠培養基

成分： 牛肉膏            ?; 3g

蛋白胨             &nb?sp;      5g

明膠          ?          120g

蒸餾水   &n?bsp;            1000ml

制法：取各成分加在蒸餾水中浸泡20min，隨時攪拌加溫使溶解，調pH至7.4，分裝于試管內，經115℃(10 1b)20min滅菌后，直立制成高層備用。

2.6 硝酸鹽蛋白胨水培養基

成分： 蛋白胨         &nb??sp; 10g

酵母浸膏          ???;       3g

硝酸鉀             ?    &nbs??p; 2g

亞硝酸鈉      &??nbs??p;        0.5g

蒸餾水             &?nbsp; 1000ml

制法：將蛋白胨和酵母浸膏加到蒸餾水中，加溫使溶解，調pH為7.2，煮沸過濾后補足液量，加入硝酸鉀和亞硝酸鈉，溶解混勻，分裝到加有小倒管的試管中，115℃(10 1b)20min滅菌后備用。

2.7 普通瓊脂斜面培養基

成分：蛋白胨 ??   &nb??sp;      10g

牛肉膏               ??&nbs??p;   3g

氯化鈉      &??nbsp;            5g

瓊脂&?nbsp;       &nbs??p;           15g

蒸餾水          &nbs??p;    1000ml

制法：除瓊脂，將其余成分溶解于蒸餾水中，調pH為7.2～7.4，加入瓊脂，加熱溶解，分裝試管，121℃(15 1b)15min高壓滅菌后，制成斜面備用。

３ 儀器

3.1 培養箱：37℃、42℃。

3.2 錐形燒瓶。

3.3 試管。

3.4 滅菌平皿。

3.5 滅菌刻度吸管。

3.6 顯微鏡。

3.7 載玻片。

3.8 接種針、接種環。

3.9 電爐。

3.10 高壓消毒鍋。

4 操作步驟

4.1 增菌培養：取1：10樣品稀釋液10ml加到90ml SCDLP液體培養基中，置37℃培養18～24h。如有綠膿桿菌生長，培養液表面多有一層薄菌膜，培養液常呈黃綠色或藍綠色。

注：如無SCDLP液體培養基時，可用普通肉湯培養基。檢驗含防腐劑的化妝品時，在每1000ml普通肉湯中加1g卵磷脂、7g吐溫80。

4.2 分離培養：從培養液的薄菌膜處挑取培養物，劃線接種在十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板上，置37℃培養18～24h。凡綠膿桿菌在此培養基上??，其菌落扁平無守型，向周邊擴散或略有蔓延，表面濕潤，菌落呈灰白色，菌落周圍培養基常擴散有水溶性色素，此培養基選擇性強，大腸艾希氏菌不能生長，革蘭氏陽性菌生長較差。

在缺乏十六烷三甲基溴化銨瓊脂時也可用乙酰胺培養基進行分離，將菌液劃線接種于平皿中，放37℃培養24H，綠膿桿菌在此培養基上生長良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周圍培養基略帶紅色，其他菌不生長。

4.3 染色鏡檢：挑取可疑的菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性者應進行氧化酶試驗。

4.4 氧化酶試驗：取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內，用無菌?玻璃棒挑取綠膿桿菌可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其?上滴加一滴新配制的1％二甲基對苯二胺試液，在15～30s之內，出現粉紅色或紫紅色時，為氧化酶試驗陽性，若培養物不變色，氧化酶試驗陰性。

4.5 綠膿菌素試驗：取可疑菌落2～3個，分別接種在綠膿菌素測定用培養基上，置37℃培養24h，加入氯仿3～5ml，充分振蕩使培養物中的綠膿菌素溶解于氯?仿液內，待氯仿提取液呈藍色時，用吸管將氯仿移到另一試管中并加入1N的鹽酸1ml左右，振蕩后，靜置片刻。如上層鹽酸液內出現粉紅色到紫紅色時為陽性，表示被檢物中有綠膿菌素存在。

4.6 硝酸鹽還原產氣試驗：挑取被檢的純培養物，接種在硝酸鹽胨水培養基中，置37℃培養24h，觀察結果。凡在硝酸鹽胨?水培養基內的小倒管中有氣體者，即為陽性，表明該菌能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產生氮氣。

4.7 明膠液化試驗，取綠膿桿菌可疑菌落的純培養物，穿刺接種在明膠培養基內，置37℃培養24h，取出放冰箱10～30min，如仍呈溶解狀時即為明膠液化試驗陽性，如凝固不溶者為陰性。

4.8 42℃生長試驗：挑取純培養物，接種在普通瓊脂斜面培養基上，放在41～42℃培養箱中，培養24～48h，綠膿桿菌能生長，為陽性，而近似的熒光假單胞菌則不能生長。

5 檢驗結果報告

被檢樣品增菌分離培養后，經證實為??革蘭氏陰性桿菌，氧化酶及綠膿菌素試驗皆為陽性者，即可報告被檢樣品中檢出有綠膿桿菌。如綠膿菌素試驗陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產??氣和４２℃生長試驗三者皆為隉性時，仍可報告被檢樣品中有綠膿桿菌。

附加說明：

本標準由中國預防醫學科學院環境衛生監測所歸口。

本標準由“化妝品微生物標準檢驗方法”起草小組起草。

本標準主要起草人周淑玉。

本標準由中國預防醫學科學院環境衛生監測所負責解釋

注解：
（1）分離綠膿桿菌常用以下幾種培養基：

1）十六烷三甲基溴化銨瓊脂（CA）

2）明膠十六烷三甲基溴化銨瓊脂（GCA）

成分為：蛋白陳20g，無水氯化鎂1.4g，無水硫酸鉀10g，明膠（BG）75g，瓊脂18～20g，十六烷三甲基溴化銨（cetrimide）0.3g，甘油（CP）10ml，蒸餾水1000ml， pH7.6。在本平板上可直接觀察是否液化明膠（菌落周圍有液化環），并可測試氧化酶和綠膿色素，提前診斷。

上述這兩種培養基具有較強的選擇性和鑒別作用，除綠膿桿菌和極少數假單胞菌及革蘭氏陰性桿菌可以生長外，絕??大部分革蘭氏陰性桿菌，??假單胞菌及革蘭氏陽性菌的生長，完全受到抑制。因為綠膿桿菌具有可利用十六烷的溴化銨鹽這一重要特性，故很多國家已普遍利用此特性分離該菌，證明效果很好。但往往出現無色素、菌落較小、無蔓延生長等現象，因此在選取菌落時須注意，以免漏檢。

3）乙酰胺瓊脂培養基（Acetamide）主要成分為乙酰胺??。乙酰胺酶是綠膿桿菌特有的酶類。綠膿桿菌能分解乙酰胺，故在此培養??基上能生長，而其他菌不生長。

4）NAC瓊脂培養基，其成分為：蛋白陳20g、磷酸氫二鉀和硫酸鎂各0.3g，十六烷三甲基溴化胺（cetrimide）0.2g及萘啶酸（nalidixic acid）15mg（商稱NAC），瓊脂15g，加蒸餾水1000m1，pH為7.4。

在NAC培養基中，綠膿桿菌生長良好，有些熒光假單胞菌，惡臭假單胞菌和腐敗假??單胞菌可緩慢生長或不長，而大腸埃希氏菌、志賀氏菌、沙門氏菌、變形桿菌、克雷伯氏菌和腸道桿菌科的其他菌屬、產堿桿菌屬、氣??單胞菌屬、弧菌屬以及葡萄球菌和鏈球菌屬等，完全受到抑制不能生長。因此NAC培養基是一種選擇性很強的綠膿桿菌培養基。日本采用NAC培養基分離化妝品中綠膿桿菌。 CTFA采用十六烷三甲基溴化銨培養基分離綠膿桿菌。在我國化妝品標準檢驗方法中規定十??六烷三甲基溴化銨和乙酰胺二種培養基均可使用，

這是考慮到有的地區十六烷三甲基溴化銨不易買到。

（2）綠膿桿菌與其他常見假單胞菌及革蘭氏陰性桿菌的鑒別。

假單胞菌屬分為四個菌群：29個代表菌種。其中同人類與動物疾病有重要關系的大約有10種，而綠膿桿菌（pseudomonas aeruginosa）又是其中最有代表性的致病菌種。常見的其他菌種有：熒光假單胞菌（PS flaorescens）、惡臭假單胞菌PS Putida）、蔥頭假單胞菌（PS cepacia）、類鼻疽假單胞菌（PS Pseudomallei）、嗜麥芽假單胞（PS maitophilia）、腐敗假單胞菌（PS Putretf aciens）、斯氏假單胞菌（PS Stutzeri）、產堿假單胞菌（PS alcaligenes）和類產堿假單胞菌（PS Pseudoalcaligenes）等九種。此外，在日常檢驗工作中尚有一些非假單胞菌屬的其他革蘭氏陰性桿菌，如氧化木糖無色桿菌（A xy-losoxidans）、產堿桿菌屬(AlcaligenesSP)和糞產堿桿菌（A faecalis）等均容易與上述假單胞菌混淆，主要鑒別列表3-1-3中。

（3）綠膿桿菌血清學試驗

在微生物諸多研究方法中，血清學方法是重要方法之一，被廣泛應用于實驗診斷中。

對綠膿桿菌血清分型的研究，早在1903年Eisenberg就已致力于這一工作。我國也進行了大量工作，以O抗原為依據，研制成了國際抗原分型系統（IATS）20型分型血清，分型率達99.4％，是當前各國分型系統中分型率高的分型方案。

綠膿桿菌血清學試驗采用玻片凝集法。先用PI～PⅣ多價血清分別與待檢活菌培養物作凝集試驗，陽性者再?用??單價分型血清作凝集試驗。判斷標準：立即出現強凝集（＋＋＋＋），3～5ｓ出現強凝集（＋＋＋），6～10s出現凝集（＋＋）， 11～15s出現凝集（＋）,16～30s不出現凝集（一），以（＋＋）以上為陽性結果。

對綠膿桿菌既作生化鑒定,又作血清凝集試驗,更有利于結果的判定。

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