1.增菌

A、碎牛肉

　　稱取25g樣品,置于勻質杯中,加入100mL增菌肉湯.用勻質器以8000-10000r/min勻質30s。將勻質液通過滅菌紗布,倒入250mL三角瓶中,于微氧條件下,37℃預增菌4h后,42℃培養20-44h。

B、凈膛全禽和分割肉

　　在一個滅菌容器中,用250mL滅菌營養肉湯振搖洗滌樣品5min.肉湯經滅菌紗布過濾,于23000xg、4℃離心20min,或于16300xg、4℃離心30min,棄去上清液,將沉淀物置于250mL三角瓶中,加入100mL增菌肉湯,搖勻。 于微氧條件下,37℃預增菌4h后,42℃培養20-44h。

C、牛奶

　　稱取40g牛奶放入離心管中,按2.條中方法離心.棄去脂肪和上清液將沉淀物置于250mL三角瓶中,加入100mL增菌肉湯,搖勻。于微需氧條件下,35℃預增菌4h后,42℃培養20-44h。

D、貝類

　　將100g樣品和100mL增菌肉湯放入均質杯中,用均質器以8000-10000r/min均質30s。用滅菌紗布過濾,取濾液50mL濾液放入500mL三角瓶中,加入200mL增菌肉湯, 于微氧條件下,37℃預增菌4h后,42℃培養20-44h。

E、河水或污水

　　取水樣2-4升,每升水樣加入5mL1M硫代硫酸鈉,用0.45μm微孔濾膜過濾,立即將濾膜置

　　于100mL增菌肉湯中, 于微氧條件下,30℃預增菌3h后,再于37℃增菌2h,然后于42℃培養20-44h。

2.分離和初步鑒定

　　取5mL經20-44h增菌的培養物,以0.65μm孔徑濾膜過濾.取經過濾和未經過濾的增菌培養物,分別在分離用瓊脂平板上劃線接種,各不少于二個平板.將平皿置于微需氧條件下42℃培養24-48h。檢查平板上有無透明-白色-棕黃色(可能出現淺紅色)凸起、邊緣不整齊、有時沿接種線向外擴散的菌落.挑取典型菌落制作濕片,用相差(或暗視野)顯微鏡檢查,本菌呈快速螺旋運動。涂片作革蘭氏染色鏡檢時,本菌為革蘭氏陰性,如小逗點狀,兩菌體的末端相連時,呈S形、海鷗形或螺旋狀.挑取初步鑒定為彎曲桿菌的菌落,在布氏瓊脂上劃線作純分離。培養方法同上。根據生化、生長特性和抗生素敏感性試驗進行菌株證實。

3.證實試驗

　　從用作純分離的平板挑選二個典型菌落。從每個典型菌落各挑取一滿接種環,分別接種于50mL三角瓶中的4mL布氏肉湯中,于微需氧條件下42℃培養24-48h.同時接種一份陽性培養物作為對照。通常用于生長試驗和生化反應的基礎培養物是含0.18%瓊脂的布氏肉湯。該培養基分裝于試管中,每管7mL。從所有布氏肉湯中取出接種物,滴加0.2-0.3mL于瓊脂表面。

(1).生長溫度試驗

　　接種3管含0.002%中性紅(NR)的基礎培養基,其中一管置于37℃培養,檢查在這一溫度下的生長情況,并用于觀察過氧化氫酶反應。另二管分別置于25和42℃培養。每日檢查有無生長。對未生長者,需培養5d方可作出最后判斷。彎曲桿菌的生長僅限于接近培養基表面的一薄層,廣泛的生長不是彎曲桿菌屬細菌所致。

(2).過氧化氫酶試驗

　　滴加3%過氧化氫溶液于有細菌生長的試管中,產生氣泡者為陽性反應。

(3).氧化酶試驗

　　使用瓊脂平板表面經24h培養的生長物.將氧化酶試劑滴于棉拭子上,用棉拭子接觸生長物表面,接觸點變為深藍色者為陽性。

(4).硝酸鹽還原試驗

　　將供試培養物接種于含1%硝酸鉀的基礎培養基中,置空氣中于37℃培養5d.加入亞硝酸鹽檢測試劑,出現紅色者為陽性反應。

(5).1%甘氨酸中生長試驗

　　將供試培養物接種于加有NR和1%甘氨酸的基礎培養基。置空氣中于37℃培養.每日檢查有無生長,對未生長者需培養5d,方可作出最后判斷。

(6).3.5%氯化鈉中生長試驗

　　將供試培養物接種于加有NR和3.5%氯化鈉的基礎培養基。置空氣中于37℃培養.每日檢查有無生長,對未生長者需培養5d,方可作出最后判斷。

(7).硫化氫產生試驗

　　將肉湯培養物接種于加有0.02%鹽酸半胱氨酸的基礎培養基,將一根浸有飽和乙酸鉛的濾紙條懸于試管的上部(不讓濾紙條接觸培養基),旋緊試管帽。 置空氣中于37℃培養.每日檢查，觀察濾紙條是否變黑，變黑表明有硫化氫產生，為陽性反應。對未出現陽性反應者需培養5d,方可作出最后判斷。

（8）.TSI試驗

　　接種于TSI斜面，于微需氧條件35－37℃培養5d.空腸彎曲菌不產生硫化氫。所有彎曲桿菌屬為堿性/堿性反應。

(9).麥康凱試驗

　　將供試培養物接種于麥康凱培養基,于微需氧條件37℃培養3d,記錄有無生長。

(10).馬尿酸鹽水解試驗

　　用試管分裝馬尿酸鹽水解培養基,每管0.4mL,凍存備用。將瓊脂平板上培養過夜的生長物接種于1%馬尿酸溶液中,振搖后置37℃水浴中放置2h。每管加入0.5mL茚三酮試劑(將3.5g茚三酮溶于100mL1:1丙酮和丁醇中),室溫下放置2h,出現紫色者為陽性反應。

(11).抗生素敏感性試驗

　　用滅菌棉拭子將預先準備好的布氏肉湯培養物涂布于布氏瓊脂平板。將頭孢菌新素(30μg)和奈啶酮酸(30μg)的圓紙片分別貼于平板表面。于微需氧條件37℃培養24h,檢查有無抑菌圈。

　　根據生化鑒定結果表對細菌作出鑒定。

附: 抗生素溶液

　　頭孢哌酮鈉（Sodium cefoperazone）:稱取0.5g,用水溶解后,定容于100mL容量瓶中。經0.22μm濾膜過濾。該溶液4℃保存5天。

　　三甲氧卞氨嘧啶乳酸鹽:稱取0.66g, 用水溶解后,定容于100mL容量瓶中。經0.22μm濾膜過濾。該溶液4℃保存1年。

　　萬古霉素:稱取0.5g, 用水溶解后,定容于100mL容量瓶中。經0.22μm濾膜過濾。該溶液4℃保存2個月。

　　放線菌酮:稱取1.25g, 用乙醇溶解后,用水定容于100mL容量瓶中。該溶液4℃保存1年。

　　每1000mL經滅菌的布氏增菌肉湯中加入以上4種溶液各4 mL。

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