一、厭氧菌樣品的采集Collection of anaerobic bacteria' s specimens

標本避免正常菌群污染和氧接觸，采用下列方法。

(1) 膿胸及未破潰的膿腫：皮膚消毒后， 以無菌注射器抽取(排盡空針及針頭內的氣體) ，將針頭插入無菌橡皮塞內送檢。

(2) 肺分泌物和痰標本：用支氣刷采取或環甲膜穿刺術。

(3) 尿液標本：用元菌注射器從恥骨上緣行膀脫穿刺術抽取。

(4) 血液標本：可用兩端接有無菌針頭的?塑料袋或橡皮導管，將一端針頭刺入?靜脈，待血液流出后將另一端針頭立即插入培養瓶內(瓶內負壓) ，使血液直接流入培養瓶內。

(5) 竇道、深部膿腫等的標本:可用特別采樣器采取。

二、涂片與染色Smear preparation and stain

標本涂片、革蘭染色、鏡檢，觀察細菌的形態和染色性，并估計標本中大致的含菌量，可用"少量” " + "、" ++ "、" + ++"、" ++++ "表示。鏡檢不僅能反映各種厭氧菌的特殊形態，同時也能為鑒定厭氧菌提供參考和依據。如脆弱擬桿菌菌體細長，兩端尖??：韋榮球菌是極小的革蘭陰性球菌。厭氧菌芽胞的位置、形態、大小對鑒定很有意義，必要時作芽胞形成試驗。例如，芽胞在菌體極端且大于菌體呈鼓槌狀，是破傷風梭菌的特征。根據慶氧菌的特殊形態，可初步確定有無厭氧菌?感染，及時向臨床醫師發出一級報告，建議采用哪類藥物。

三、標本接種Inoculating

一般標本接種3 個血瓊脂平板，分別放置于有氧、無氧和含5 %~ l0 % CO2 的環境中培養。如果只要求檢出厭氧菌，只需接種l 個慶氧血瓊脂平板，也可增加1 個相應的選擇慶氧血瓊脂平板。為便于在混合培養中及早發現慶氧菌，一般將標本分3 段劃線接種，在第1 和第2 段交界處貼1 張甲硝嘩(5 mg/片)紙片，若出現隱約抑菌圈，則提示有慶氧菌生長。

不同慶氧菌的生長速度和菌落形態各異??，色素也有不同，熒光產生與否也有助于鑒定，根據上述特征，??可初步推測厭氧菌的種類。

1.革蘭陰性桿菌

(1)在BBE 瓊脂平板上有灰黑色、直徑> lmm 的菌落，菌落周圍有黑色的暈，可初步鑒定為脆弱擬桿菌。

(2) 在卡那萬古溶血瓊脂平板上，有棕色或黑色菌落，或用伍德燈照射有磚紅色熒光者，為產黑素普雷沃菌。

(3)菌落沉入瓊脂內，使培養基表面留有小坑者，可能是解脲擬桿菌和纖細擬桿菌。

(4) 菌落表面有小斑點，或如面包屑，結合涂片所見，可初步鑒定為具核梭桿菌。

2. 革蘭陰性球菌 菌體很小，排列成雙、短鏈或小堆，菌落小，不透明，可能是小韋榮球菌。

3. 革蘭陽性球菌排列成長短不等的鏈，可能是消化鏈球菌。

4. 蘋蘭陽性無芽胞桿菌

(1)菌落呈臼齒形、粗糙，結核膿樣分泌物中有硫黃樣顆粒，可能是放線菌。

(2) 菌體呈X 、Y 、V 排列，菌落小，灰白，不透明，可能是丙酸桿菌。

5 . 革蘭陽性芽胞桿菌 只要見有芽胞，即可鑒定為梭菌屬。菌落有雙環溶血，卵黃平皿上卵磷脂酶試驗和Nagler 試驗陽性，涂片染色為革蘭陽性短粗桿菌，有芽胞，有莢膜，可鑒定為產氣莢膜梭菌。

四、耐氧試驗Oxygen tolerance test

當慶氧平板上有細菌生長時，為了確定是否為厭氧菌，必須做耐氧試驗。從每個瓊脂平板上挑取4~5 個性狀不同的菌落，每個菌落分別轉種于2 塊需氧血瓊脂平板和1 塊厭氧血瓊脂平板(每個瓊脂平板可劃4~6 區，每區種一個可疑菌落) ，然后將平板分別放置在需氧、二氧化碳和厭氧環境中培養。

凡在厭氧環境生長，而在需氧和二氧化碳環境中不生長的細菌為專性慶氧菌(圖3 - 48 中A 區) ;在需氧和厭氧環境中均能生長者為兼性厭氧菌(圖3 - 48 中B 區) ;在需氧和二氧化碳環境中生長，而在厭氧環境中不生長者為專性需氧菌(圖3 - 48 中C 區) ;在需氧、厭氧環境中均不生長或生長不佳，而在二氧化碳環境中生長良好的細菌為需二氧化碳菌(圖3 - 48 中D 區) 。

五、鑒定試驗Identification test

可依據厭氧菌的菌體染色形態、菌落特?性以及對某些??抗生素的敏感性作出初步鑒定。最后鑒定則要進行生化反應及終末代謝產物等檢查。

生化試驗主要包??括多種糖類發酵試驗、吲哚試驗、硝酸鹽還原試驗、觸酶試驗、卵磷脂酶試驗、脂酶試驗、明膠液化試驗及膽汁肉?湯生長試驗和硫化氫試驗等。目前用于厭氧菌快速鑒定有胞外酶試驗， 4 h 即可觀察結果;自動微生物鑒定系統，如VITEK-ANI 、MicroScan- ANI 等也可鑒定慶氧細菌。

在進行慶氧菌分離鑒定的過程中，需注意下列事項: ①厭氧菌標本在采集和運輸的過程中必須與空氣隔絕(厭氧菌暴露于空氣中時間太長可死亡) ，務必在30 min 內完成，同時應避免正常菌群的污染。②培養基要新鮮配制，若儲??存太久，有氧氣溶解在表面或有過氧化物在培養基中，不利于慶氧菌生長。③ 若菌落太小，需用放大鏡觀察菌落。④作耐氧試驗，要求從每個瓊脂平板上挑取4 ~ 5 個性狀不同的菌落，分別接種需氧和厭氧血瓊脂平板，置于需氧、二氧化碳和厭氧環境中培養。⑤ 如作胞外酶鑒定， 一定要有足夠的菌液濃度。

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