高滲透法 

1、準備

40ml（LB+0.5M山梨醇）：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl 10g/l，3.6g山梨醇pH=7.2。

200ml電轉培養基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖）：18g 山梨醇，18.5g甘露醇，20g葡萄糖。

10ml RM（0.5M山梨醇，0.38M甘露醇）：0.9g山梨醇，0.7g甘露醇。

2個50ml離心管，滅菌。

2、轉化

1）接種B.subtilis于3mlLB培養基中，過夜培養.。

2）取2.6ml過夜培養物接入40ml（LB+0.5M 山梨醇）中，37℃，200rpm培養至OD600=0.85~0.95。

3）將菌液冰水浴10 min，然后5000g，5 min，4℃離心收集菌體。

4）用50ml預冷的電轉培養基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖），重新吹懸菌體，5000g，5min，4℃離心去上清，如此漂洗4次。

5）將洗滌后的菌體吹懸于1ml電轉培養基中，每EP管分裝120。

6）將60μl感受態細胞中加入50ngDNA（1~8μl），冰上孵育2min，加入預冷的電轉杯（1mm）中，電擊一次。電轉儀設置：2.0kv，1mm,電擊1次。（電擊結果：時間常數=4.5~5.0ms，如果時間常數<4.2，則需要增加電轉培養基的漂洗次數或者提高感受態的稀釋倍數，來獲得更高的轉化效率）。

7）電擊完畢取出杯子并立即加入1ml RM（LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇），37℃，200rpm，復蘇3h后，涂板。37℃，過夜培養。

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