一.實驗目的： 

1. 了解溫度對微生物生長的影響； 

2.了解滲透壓對微生物的影響； 

3. 了解某一抗生素（鏈霉素）的抗菌范圍，學習抗菌譜試驗的基本方法。 

二.實驗原理： 

1. 溫度: ??溫度是影響微生物生長與存活的最重要因素。自然界的微生物可根據對溫度的適應性分為低溫型、中溫型和高溫型。但不管哪一種溫度型的微生物，都有生長溫度范圍。分為最高、最適和最低生長溫度。在最適宜溫度里生長良好：超過最高溫度細胞死亡；低于最低溫度細胞被抑制或死亡。 

溫度對微生物影響的實際應用：應用上利用高溫進行殺菌；低溫抑制微生物；最適溫度培養微生物的活動。 

高溫加熱滅菌法有火焰灼燒；煮沸消毒；干熱空氣滅菌；高壓蒸汽滅菌等。高溫 

?干熱致死機理：主要由于細胞內蛋白質受熱變性，蛋白質結構發生變化而凝固等。高溫熱致死的影響因素有致死溫度、高溫時間和微生物的耐熱性能。一般情況下，病原微生物細胞最不耐熱，而霉菌和放線菌的孢子、細菌芽孢最耐熱。 

低溫下多數微生物處于被抑制狀態。病原菌和一些微生物在低溫下也易死亡。其致死機理為細胞內外水份結成冰，冰晶對細胞造成損傷破壞作用。因此，應用上低溫可以用來保存食品，和在有一定措施條件下進行保存菌種。

2.滲透壓的影響：在等滲溶液中，（環境滲透壓和細胞內滲透壓相同或相近，細胞在等滲環境中生長好，如0.85??％氯化鈉——生理鹽水），微生物正常生長。在高滲溶液（如高鹽、高糖溶液中），細胞失水收縮，從而抑制了微生物體內的生理生化反應，抑制其生長繁殖。而在低滲溶液中，由于細胞壁的保護作用，微生物受低滲的影響不大。 

不同類型的微生物對滲透壓變化的適應能力不盡相同，大多數微生物在0.5％3％的鹽濃度范圍內可正常生長，10～15％的鹽濃度能抑制大部分微生物的生長，但對嗜鹽細菌而言，在低于15％的鹽濃度環境中不能生長，而某些極端嗜鹽菌可在鹽濃度高達30％的條件下生長良好。 

本實驗選擇了金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為實驗菌種，其中大腸桿菌耐高滲透壓的能力較差，在3%以下的NaCl下能正常生長，以5%的NaCl下即受到抑制；金黃色葡萄球菌有較強的耐鹽能力，它在10%的NaCl溶液中仍能正常生長，因此實驗選擇了0.85%、5%、15%的NaCl溶液濃度作為實驗濃度。 

3. ?抗生素的影響：抗生素是某些微生物在生長代謝過程中產生的能抑制或殺死其它微生物的次生代謝產物。每種抗生素都有它固定的抗菌范圍和抗菌譜，例如青霉素只對革蘭氏陽性菌具有抗菌作用，多粘菌素只對革蘭氏陰性菌有作用，這類抗生素稱為窄譜抗生素；另一些抗生素對多種細菌具有作用，例如四環素、土霉素對許多革蘭氏陽性菌和陰性菌都有作用稱為廣譜抗生素。 

??本實驗選擇了大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌作為實驗菌種，選擇了鏈霉素作為實驗抗生素。通過實驗觀察這種抗生素的抑菌范圍。 

三. 實驗用品：參考實驗教材上的實驗用品。 

四. 實驗內容（三人一組）： 

1、每組分別倒制含有0.85%、5%、15%的NaCl濃度的肉膏蛋白胨培養基平板，于實驗桌上靜置待其凝固。其中含有0.85%NaCl濃度的倒制兩塊平板。【每組共四塊平板，0.85％的2塊、5%、15%的各一塊】 

2. 從斜面上刮取大腸桿菌、枯草芽孢桿菌分別放入10mL無菌水中，制備成菌懸液，于沸水浴中煮沸10min后備用。 

3. 取一塊已經凝固的0.85％NaCl濃度的平板分成6等分，分別用接種環接種沒有經沸水浴的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌斜面，和經過沸水浴的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌菌懸液；并在平板底相相應地標記好，于37℃倒置培養2天觀察平板上的細菌生長情況。從而觀察它們對溫度敏感性的差異，思考產生這種差異的原因。 

4. 將已經凝固的5%、15%的NaCl濃度的肉膏蛋白胨培養基平板用記號筆分區劃分為兩等分，分別接種大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，并在平板底相相應地標記好，于37℃倒置培養2天觀察平板上的細菌生長情況。從而觀察它們對滲透壓敏感性的差異。 

5. 用無菌鑷子取無菌濾紙條一條，浸入鏈霉素溶液中，潤濕，并在容器內壁瀝去多余溶液，再將濾紙條貼在已經凝固的另一塊0.85％NaCl濃度的平板上。 

   ??注意：濾紙條上含有的溶液不要太多，而且在貼濾紙條時不要在培養基上拖動濾紙條，避免抗生素溶液在培養基中擴散時分布不均勻。 

6. 無菌操作，用接種環，從濾紙條邊緣分別垂直向外直線接種大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌。于37℃倒置培養2天觀察并記錄平板上的細菌生長情況。

  注意：劃線接種時要盡量靠近濾紙條，但不要接觸，避免將濾紙條上的抗生素溶液與菌種混合。 

五.備注： 

引子：青霉素是抗菌素的一種，是從青霉菌培養液中提制的藥物，是第一種能夠治療人類疾病的抗生素。　 

青霉素的發現者是英國細菌學家弗萊明。1928?年的一天，弗萊明在他的一間簡陋的實驗室里研究導致人體發熱的葡萄球菌。由于蓋子沒有蓋好，他發覺培養細菌用的瓊脂上附了一層青霉菌。這是從樓上的一位研究青霉菌的學者的窗口飄落進來的。使弗萊明感到驚訝的是，在青霉菌的近旁，葡萄球菌忽然不見了。這個偶然的發現深深吸引了他，他設法培養這種霉菌進行多次試驗，證明青霉素可以在幾小時內將葡萄球菌全部殺死。弗萊明據此發明了葡萄球菌的克星—青霉素。 

1929年，弗萊明發表了學術論文，報告了他的發現，但當時未引起重視，而且青霉素的提純問題也還沒有解決。 

　　1935??年，英國牛津大學生物化學家錢恩和物理學家弗羅里對弗萊明的發現大感興趣。錢恩負責青霉菌的培養和青霉素的分離、提純和強化，使其抗菌力提高了幾千倍同，弗羅里負責對動物觀察試驗。至此，青霉素的功效得到了證明。 

由于青霉素的發現和大量生產，拯救了千百萬肺炎、腦膜炎、膿腫、敗血癥患者的生命，及時搶救了許多的傷病員。青霉素的出現，當時曾轟動世界。為了表彰這一造福人類的貢獻，弗萊明、錢恩、弗羅里于1945年共同獲得諾貝爾醫學和生理學獎。 

   鏈霉素發明于1944年。是一種從灰鏈霉菌的培養液中提取的抗菌素。它的抗結核桿菌的特效作用，開創了結核病治療的新紀元。從此，結核桿菌肆虐人類生命幾千年的歷史得以有了遏制的希望。

1.物理因素對微生物的影響 

a.溫度: 

b.?干燥：干燥指沒有水分或缺少水分的環境。微生物對干燥較為敏感。病原菌在干燥的環境下會較快死亡；一些微生物在長期干燥環境中緩慢死亡；部分抗干燥微生物仍能存在，但生命受到抑制。因此，干燥廣泛應用于控制微生物，保存食品等。 

C.滲透壓：指溶液中水分子由于滲透作用所產生的壓力。 

等滲：環境滲透壓和細胞內滲透壓相同或相近，細胞在等滲環境中生長好。如0.85％氯化鈉（生理鹽水）就是等滲透壓環境。 

?高滲：環境滲透壓高于細胞內滲透壓。細胞脫水，嚴重時細胞質膜分離死亡。高滲透壓環境可用于制造與保藏食品，如高鹽和高糖食品不易變質就是這個道理。 

低滲：環境滲透壓低于細胞內滲透壓。細胞大量吸水而膨脹，甚至破裂死亡。  

d.超聲波：指人耳朵聽不見的聲波。波長在9～20千赫/秒以上對微生物有破壞作用。超聲波致死機理：振蕩使細胞受到損傷，以及介質發熱產生較高的溫度對細胞的致死作用。超聲波常用于提取細胞內的DNA、酶等進行遺傳工程的分析。 

e.輻射：能量通過空間傳遞的電磁波。在射線中，有紫外線、r射線等。微生物對射線極為敏感。 

紫外線：波長比最短的可見光還要短，其殺菌波長在260nm時殺菌力最強。紫外線殺菌機理是細胞中DNA??遭到破壞，形成胸腺嘧啶二聚體。紫外線殺菌特點：殺菌力強，穿透力弱，受傷的細胞具有光復活作用。應用上可作為空氣及物體表面消毒殺菌，菌種育種等。 

x 射線、r射線等具有更強的致死作用。 

f.?過濾除菌：硅藻土過濾器用于水體等液體過濾；棉花纖維過濾器用于發酵工業的空氣過濾；超細玻璃纖維過濾器用于超潔凈工作臺空氣的微生物過濾等。 

2.化學因素對微生物生命活動的影響 

化學物質濃度決定著影響作用：濃度合適是微生物的營養物；濃度高時成為抑制劑或成為殺菌劑。 

a.pH: 微生物生長在適宜的酸堿度環境中，如細菌、放線菌、藻類、原生動物等最適pH多為6.5～8.5（7.5左右）；酵母、霉菌最適pH多為4～6；少數微生物能在pH<2或pH>10環境中生長，這些微生物稱為極端微生物。 

酸堿影響微生物生長的機理：細胞中DNA、ATP、蛋白質易遭到酸堿破壞，酸堿還影響細胞膜與酶蛋白的電荷，影響物質吸收和催化。 

酸堿在控制微生物上的應用：乳酸、醋酸、堿等可作為消毒劑。如石灰水（2％CaO3的水溶液）、NaOH、NaCO3等常作為廠房、環境等衛生的消毒劑。 

b.重金屬鹽類 

重金屬離子對微生物有毒害作用。殺菌機理是與細胞蛋白質結合使之變性，或金屬離子與酶SH基結合而使酶失去活性。 

HgCL2（升汞），濃度在1:500～1:2000對細菌殺菌作用強。但對金屬有腐蝕作用，對人與動物有劇毒，因此少用。 

Ag鹽：AgNO3是溫和的殺菌劑，0.1～1％可用于消毒皮膚。 

Cu鹽：CuSO4對真菌與藻類殺傷力強，供水系統常使用CuSO4 殺藻。 

c.     氧化劑 

指本身能放出游離氧或能使其它化合物放出氧的物質。氧化劑能導致微生物細胞物質氧化，代謝紊亂而死亡。 

高錳酸鉀：0.1～0.3％用于清潔后的物體表面（皮膚、蔬菜及水果等）消毒。酸性下殺菌有效，堿性下產生MnO2沉淀（殺菌減弱）。需現配現用。 

Cl2、漂白粉、氯胺等含氯氧化劑，用于飲用水、廠房、工具等消毒。Cl2消毒劑量0.2～1ppm；漂白粉（次亞氯酸鈣）Ca(OCl)2常用濃度為0.5～1.2％。實踐中常以10％石灰水5份和5％漂白粉1份混合應用于環境、廠房等場地衛生的噴灑消毒。 

d.有機物（酚、醇、醛） 

酚類為強消毒殺菌劑。2～5％的苯酚（石碳酸）常作為實驗室玻璃器具以及環境等衛生消毒殺菌。 

醇類殺菌隨分子量增加殺菌效果提高。但分子量大的醇對人體有毒害作用，且不易與水結合。60～75％乙醇是常用消毒劑。碘＋乙醇（碘酒）殺菌效果更好。 

甲醛：純甲醛是氣體。35～40％甲醛水溶液為福爾馬林。福爾馬林殺死細菌與真菌效能強，是制作動物、植物標本的防腐劑。5％甲醛可以噴灑、熏蒸，用于空氣、接種室等環境的消毒殺菌。 

e.表面活性劑：指具有降低表面張力效應的物質。如肥皂、新潔爾滅等都是皮膚良好的消毒劑。 

f.染料：染料也具有抑菌或殺菌作用。堿性染料殺菌能力強于帶負電荷的酸性染料。 

g.氧化還原電位（E值）：近年來用于給排水工程的科學研究與指導廢水處理的運轉工作中。它反映了微生物生長代謝環境的氧化還原電位。好氧處理系統如氧不足，電位低，兼性或厭氧微生物則生長代謝，水體處理質量下降。

好氧微生物：   E值   +0.3～0.4V才能生長 

厭氧微生物：   E值  <+0.1V才能生長 

兼性厭氧微生物：E 值 >+0.1V進行好氧呼吸；E值<+0.1V進行厭氧呼吸。

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