大腸桿菌質粒DNA的提取(堿裂解法)
此方法適用于小量質粒DNA的提取提取的質粒DNA可直接用于酶切PCR擴增。
1 ). 取1.5ml細菌培養物于EP管中,4000rpm離心1分鐘,棄上清液,使細菌沉淀盡量干燥;
2 ). 將細菌沉淀重懸于用冰預冷的100 µl溶液I (50 mmol/L葡萄糖,10 mmol/L EDTA pH 8.0,25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 中,劇烈振蕩;
3 ). 加入200 µl新配制的溶液II(0.2 mol/L NaOH,1%SDS(m/v)),蓋緊EP管口,快速顛倒離心管5次,以混合混合物,確保離心管的整個內表面與溶液II接觸,不要渦旋,置于冰浴中;
4 ). 加入150 µl預冷溶液III(每100 ml 的溶液III中含60 ml 5 mol/L 乙酸鉀,11.5 ml冰乙酸,28.5 ml H2O),蓋緊EP管口,反復顛倒數次,使溶液III在粘稠的細菌裂解物中分散均勻,之后將管置于冰上3~5分鐘;
5 ). 在最大轉速下離心5min,取上清液于另一新EP管;
6 ). 用兩倍體積的乙醇室溫沉淀雙鏈DNA,振蕩混合于室溫放置2分鐘,最大轉速離心5分鐘;
7 ). 小心吸去上清液,將離心管倒置于濾紙上,以使所有液體都流出,在將附于管壁的液滴除盡;
8 ). 加1ml 70%乙醇洗滌沉淀,振蕩混合,用12,000g離心2分鐘,棄上清,將開口的EP管置于室溫使乙醇揮發,直至EP管中內沒有可見的液體存在(5~10分鐘),用適量的ddH2O溶解;
9 ). 用0.5µl的RNase 37℃溫育5~10分鐘;
10 ). 電泳鑒定。