幾種海藻及海洋細菌的DNA制備方法

錄入時間:2011-9-9 16:42:33 來源：生物在線

眾所周知，海藻由于富含多糖，DNA提取是一大難題，一下是本人在試驗過程中收集的海藻DNA制備方法，經試驗驗證可行，現在貼出來，以觴眾戰友。
一、可大量培養的海洋細菌
1、取1ml目的菌菌液至1.5ml的EP管中，5000r/m離心5分鐘棄上清，菌體加入500μl水洗滌一次，5000r/m離心5分鐘，棄上清，向菌體中加入200μl懸浮緩沖液。
2、在200μl懸浮緩沖液中加人55℃Tirs飽和酚200μl和10%的SDS 45μl混勻，在微型蝸旋混和儀上混勻，55℃溫浴15分鐘，并且不斷振蕩混勻。
3、12000r/m離心5分鐘，取上層水相移至新的EP管中。
4、加入等量的氯仿/異戊醇抽提，12000r/m離心5分鐘，轉移上層水相至新管，反復抽提至界面澄清。
5、取上層水相加入0.1倍的3M醋酸鈉和2.5倍體積的無水乙醇混勻于-20℃放置2h沉淀DNA。
6、12000r/m離心20分鐘，沉淀DNA棄上清，用預冷的的70%的乙醇洗2次，在室溫下晾干，加入40μl無菌水溶解，-20℃保存。
本方法用于海洋假單孢菌、以及部分蘭細菌（藍藻）可行。

二、從海水中制備細菌/浮游生物的混合DNA
海洋浮游生物生物量較小，往往需要采集大量的海水樣本，過濾收集特定粒徑的浮游生物。這里介紹的是一種簡單、快速、實用的符合環境指示基因PCR擴增需要的浮游生物模板DNA制備方法。
1、取40 μL水樣，與等體積0.25 mol/L NaOH混合，并于25 ℃溫育過夜。
2、99 ℃加熱10 min，冷卻至室溫，簡單離心收集溶液，依次加入8 μL 1 mol/L HCl，20 μL 0.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）和10 μL 2% （v/v，體積分數）Triton X-100，混合并離心。
3、將混合溶液再次在99 ℃加熱10 min。
4、制備的模板DNA溶液pH值在8到9之間，可直接用于PCR擴增反應，不需要其它純化處理。
本方法用于海洋弧菌可行。

三、褐藻
Approximately 500mg of fresh leaves were ground in liquid nitrogen, transferred to the lysis buffer (1.5% CTAB, 75mM Tris-HCl, 1.5mM EDTA, 1.0M NaCl, 0.5mg/ml RNase A), and incubated for 30 min at 65℃. Proteinase K (final concentration of 10 mg/ml) was added and incubation continued for 30 min at 37℃. An equal volume of phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) was added, mixed and the sample centrifuged at 2,300g for 20 min. Approximately 500μl of upper aqueous layer was transferred to a new tube and 50μl of 10% CTAB (10% CTAB, 0.7 M NaCl), an equal volume of phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) was added, mixed and the sample centrifuged at 2,300g for 20 min. The upper aqueous layer was transferred to a new tube and an equal volume of 1% CTAB (10% CTAB, 50mM Tris-HCl, 10mM EDTA) was added, mixed and the sample centrifuged at 1,000g for 10 min. The DNA was precipitated. The DNA was washed with 70% ethanol. Then the DNA pellet was air-dried and redissolved in TE (Tris-EDTA) buffer.
本方法用于鼠尾藻，可行。

四、紅藻
1、取1g藻體，用蒸餾水洗凈，加入大約2ml提取緩沖液[4% SDS, 0.05 M Tris. HCl，pH8.0, 0.1M EDTA, 0.2MnaCl]，在0℃冰浴中充分研磨后，加蛋白酶K(終濃度100ug/ml)，在50℃水浴間斷震蕩3.5-4小時。
2、15,000 rpm離心10min，取上清液，加等體積的酚抽提, 15,000rpm離心10min。
3、取上清液，再以酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)及氯仿抽提，15,000rpm離心10min。
4、取上清液，加入二倍體積的無水乙醇使DNA沉淀，離心，用70%的乙醇洗沉淀兩次。
5、干燥后，溶解在50ul無菌TE(10mMTris, 0.1mM EDTA,PH8.0)中，-20℃儲存備用。
本方法用于紫菜孢子體、紫菜配子體、江蘺、龍須菜可行。

五、甲藻
1、取對數生長期的培養物，在 4 ℃下用冷凍離心機6000 rpm離心 6 min，收集藻細胞。
2、收集的藻細胞放于液氮中冷凍半個小時后，在研缽中研磨成粉末，轉移到 1.5mL 的滅菌離心管中，加入總體積 700μL 裂解緩沖液(100mM EDTA, pH 8.0；10 mM Tris-HCl, pH 8.0；1% SDS；200 μg/mL Protease K)放于55 ℃溫浴 3 h，其間不時搖動。
3、待溶液澄清透亮裂解完全后，用一倍體積的平衡酚抽提一次, 吸取上清轉移至另一滅菌管中; 上清用一倍體積的平衡酚：氯仿（25:24）抽提一次，吸取上清移至另一滅菌管中；上清再用一倍體積的平衡酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）抽提一次，吸取收集上清；收集的上清液加入十分之一體積 3 M 醋酸納和兩倍體積冰預冷的無水乙醇，-20 ℃過夜放置。
4、第二天12000 rpm離心20min后棄去上清，DNA 沉淀用 70%的乙醇洗滌兩次，晾干。
5、最終溶解于 50 μLTE 緩沖液 (10 mM Tris-HCl pH 8.0；1 mM EDTA)。
本方法用于塔瑪亞歷山大藻、原甲藻可行。

六、藍藻（以前在reply過，現在集中到這里）
solution I： 100 mM NaCl, 30 mM Tris.Cl （pH 7.8）, 10 mM EDTA
solution II：0.1 M NaCl，0.2 M蔗糖，10 mM EDTA
裂解液： 0.25 mM EDTA, 0.5 M Tris.Cl, （pH 9.2），2.5% SDS，10 mM ?-巰基乙醇
TAE： 40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA
TE： 20 mmol/l Tris. Cl (8.0), 1 mmol/l EDTA (8.0)
1、稱取1 g干藻粉置于eppendorf 管中；
2、加入0.5 ml solution I，振蕩1 min；
3、 10,000 rpm離心1 min，棄上清；
4、重新加入0.5 ml solution I洗滌，收集沉淀；
5、用0.6 ml solution II懸浮沉淀后，加入0.2 ml 裂解液，劇烈振蕩1 min；
6、55 ?C水浴1 h；
7、加入等體積的酚/氯仿/異戊醇抽提兩次（10,000 rpm, 8 min）；
8、用等體積的氯仿/異戊醇（10,000 rpm, 8 min）抽提1次后收集上清；
9、加入1/10體積的3 M NaAc（pH 5.2）和2倍體積的無水乙醇；
10、室溫沉淀20 min, 10,000 rpm離心8 min；
11、70 %乙醇洗滌沉淀除鹽兩次并吹干；
12、50 ?l ddH2O溶解沉淀；
13、加入RNaseA去RNA，電泳檢測后- 20 ?C保存備用。
本方法用于螺旋藻、節旋藻可行。

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