一、堿變性法提取質粒DNA
?質粒(Plasmid)是細菌染色體外能自身獨立復制的雙股環狀DNA。帶有遺傳信息,可賦予細菌某些新的表型。將質粒指紋圖譜分析方法、質粒 DNA探針技術及檢測質粒的PCR技術用于臨床感染性疾病的診斷和流行病學調查已成為現實。質粒作為載體在基因工程中起著重要的作用。
??分離和純化質粒DNA的方法很多,但這些方法基本包括三個步驟:即細菌的培養和質粒DNA的擴增;細菌菌體的裂解;質粒DNA的提取與純化。
本實驗學習用堿變性方法提取質粒DNA 。
【原理】
?細菌培養物加入SDS和NaOH堿性溶液處理后,菌體裂解,可使細菌的質粒DNA、染色體DNA和RNA一起從細胞內釋放出來,經瓊脂糖凝膠電泳,因各種核酸分子的遷移率不同將上述核酸分成不同的帶。用溴化乙錠(EB)染色后,在紫外線燈下可看到各種核酸帶發出的熒光。根據熒光的位置,可區分不同的核酸帶。
【材料】
1、菌株E.coliJM109(pUC19),E.coliRRI(pBR322)
2、試劑溶液Ⅰ(50mM葡萄糖,25mMTris.HclPH8.0,10mMEDTA)
溶液II(0.2NNaOH,1%SDS)用前新配制
溶液III(5mMKAc溶液,PH4.8)
TE緩沖液(10mMTris.Hcl,1mMEDTA,PH8.0)
??
LB液體培養基(胰蛋白胨10g,酵母粉5g,Nacl10g,加蒸餾水溶解,用NaOH調PH至7.5,加水至1000ml,15磅高壓滅菌15分鐘。)
【方法】
1、接種細菌于5mlLB液體培養基中,37℃培養過夜。
2、3000rpm/min,離心15min,棄上清。加入100ul溶液Ⅰ懸起細菌沉淀。
3、加入200ul前新配制的溶液II,顛倒EP管5次混合均勻,置冰浴2min。
4、加入150ul溶液III溫和地混勻,12000rpm/min,離心5min。
??5、吸取上清清亮裂解液放入另一新EP管中,加等體積酚-氯仿-異戊醇抽提2次,12000rpm/min,離心2min。(若不做酶切,此步可省略)吸取上清放入另一新EP管中,加入二倍體積的冷乙醇,12000rpm/min,離心10min。
6、棄乙醇,干燥后用30ulTE緩沖液洗下核酸,待電泳檢測。