本世紀60至70年代對大腸桿菌的研究使之成為自然界中最普遍為人們所認識的生物體。大腸桿菌具有兩個顯著特征：操作簡單和能在廉價的培養基中高密度培養，它的這些特征加上十多年外源基因表達的經驗使其在大多數科研應用中成為高效表達異源蛋白最常用的原核表達系統。盡管大腸桿菌有眾多的優點，但并非每一種基因都能在其中有效表達。這歸因于每種基因都有其獨特的結構、mRNA的穩定性和翻譯效率、蛋白質折疊的難易程度、宿主細胞蛋白酶對蛋白質的降解、外源基因和E.coli在密碼子利用上的主要差別以及蛋白質對宿主的潛在毒性等等。但知識的大量積累還是有助于為表達方面某些特定的困難提供一般的解決方法。大腸桿菌作為表達系統的主要障礙包括：不能象真核蛋白那樣進行翻譯后修飾、缺乏將蛋白質有效釋放到培養基中的分泌機制和充分形成二硫鍵的能力。另一方面，許多真核蛋白在非糖基化的形式下能保留其生物學活性，因而也就可以用大腸桿菌來表達。如何實現外源基因在原核細胞中的有效表達，自60年代以來，對影響外源基因在其表達體系中表達效率的各個因素作了大量實驗研究，并有多篇歸納性綜述發表[1，2，3]。國內針對外源基因在原核細胞中高效表達的關鍵因素，構建了高效表達載體[4]，并在此基礎上成功表達了一系列細胞因子的基因[5，6，7]。龙8娱乐官方网站在分析了國內外有關在原核系統中表達蛋白的實驗資料的基礎上，對在大腸桿菌中高效表達外源蛋白的策略所涉及的內容進行全面的總結，以期有助于我國在這方面的研究。
l 有效表達載體的構型
構建表達質粒需要多種元件，需要仔細考慮它們的組合，以保證最高水平的蛋白質合成。E.coli表達載體的基本結構如圖1所示[8]。
RBS
P
R -35 -10 SD coding sequence TT Tet Ori
-35 -10 Stop codon
TTGACA(N)17TATAAT UAAU
UGA
UAG
Start codon
mRNA 5' UAAGGAGG(N)8 AUG(91%)
16S rRNA 3'HOAUUCCUCC GUG(8%)
UUG(1%)
啟動子(以雜和的tac啟動子為例)位于核糖體結合位點（RBS）上游10-100bp處，由調節基因（R）控制，調節基因可以是載體自身攜帶，也可以整合到宿主染色體上。E.coli的啟動子由位于轉錄起始位點上游約35bp的六核苷酸序列（-35區）和一短序列隔開的另一六核苷酸序列（-10區）組成[9,10,11]。有許多啟動子可用于在E.coli中的基因表達，包括來源于革蘭氏陽性菌和噬菌體的啟動子。理想的啟動子具有以下特性：作用強;可以嚴格調控;容易轉導入其他E.coli以便篩選大量的用于生產蛋白的菌株，而且對其誘導是簡便和廉價的[12]。在啟動子下游是RBS，其跨度約為54個核苷酸，兩端限定在 -35（±2）和mRNA編碼序列的+19到+22之間[13]。Shine-Dalgarno(SD)位點[14,15]在翻譯起始階段與16S rRNA的3'端相互作用[16]。SD與起始密碼子間的距離約為5-13bp[17]，而且此區的序列在mRNA轉錄物中應避免出現二級結構，否則將會降低翻譯起始的效率[18]。在RBS的5'和3'端均為A豐富區[19]。轉錄終止子位于編碼序列的下游，作為轉錄終止的信號[20]和組成發卡結構的保護性元件，阻止核酸外切酶對mRNA的降解，從而延長mRNA的半衰期[21]。
除了上述對基因表達的效率有直接影響的元件以外，載體還含有抗生素抗性基因，以方便質粒的篩選和傳代。氨芐青霉素是最常用的抗性標記。但在生產人用治療性蛋白時，最好選擇其他抗性標記(如Tet)以避免可能發生的過敏反應[22]。質粒的拷貝數由復制起點決定。在特殊情況下，選用失控復制子能夠獲得大量的質粒拷貝數和較高產量的質粒編碼蛋白[23，24]。但在另外一些情況下，選用超過pBR322的高拷貝質粒似乎并沒有好處。而且已有資料表明，增加質粒的拷貝數降低E.coli中胰酶的產量，在高拷貝質粒中，強啟動子的存在嚴重影響了細胞的活性[25，26]。
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