把一個有用的目的DNA段通過重組DNA技術,送進受體細胞中去進行繁殖和表達的工具叫載體(Vector)。細菌質粒是重組DNA技術中常用的載體。

　　質粒(Plasmid)是一種染色體外的穩定遺傳因子,大小從1-200kb不等,為雙鏈、閉環的DNA分子,并以超螺旋狀態存在于宿主細胞中。質粒主要發現于細菌、放線菌和真菌細胞中，它具有自主復制和轉錄能力,能在子代細胞中保持恒定的拷貝數,并表達所攜帶的遺傳信息。質粒的復制和轉錄要依賴于宿主細胞編碼的某些酶和蛋白質，如離開宿主細胞則不能存活,而宿主即使沒有它們也可以正常存活。質粒的存在使宿主具有一些額外的特性,如對抗生素的抗性等。F質粒(又稱F因子或性質粒)、R質粒(抗藥性因子)和Col質粒(產大腸桿菌素因子)等都是常見的天然質粒。

　　質粒在細胞內的復制一般有兩種類型:緊密控制型(Stringent control)和松馳控制型(Relaxed control)。前者只在細胞周期的一定階段進行復制,當染色體不復制時,它也不能復制,通常每個細胞內只含有1個或幾個質粒分子,如F因子。后者的質粒在整個細胞周期中隨時可以復制,在每個細胞中有許多拷貝,一般在20個以上,如Col E1質粒。在使用蛋白質合成抑制劑-氯霉素時,細胞內蛋白質合成、染色體DNA復制和細胞分裂均受到抑制,緊密型質粒復制停止,而松馳型質粒繼續復制,質粒拷貝數可由原來20多個擴增至1000-3000個,此時質粒DNA占總DNA的含量可由原來的2%增加至40-50%。

　　   利用同一復制系統的不同質粒不能在同一宿主細胞中共同存在,當兩種質粒同時導入同一細胞時,它們在復制及隨后分配到子細胞的過程中彼此競爭,在一些細胞中,一種質粒占優勢,而在另一些細胞中另一種質粒卻占上風。當細胞生長幾代后,占少數的質粒將會丟失,因而在細胞后代中只有兩種質粒的一種，這種現象稱質粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同復制系統的質粒則可以穩定地共存于同一宿主細胞中。

質粒通常含有編碼某些酶的基因,其表型包括對抗生素的抗性,產生某些抗生素,降解復雜有機物,產生大腸桿菌素和腸毒素及某些限制性內切酶與修飾酶等。

　　質粒載體是在天然質粒的基礎上為適應實驗室操作而進行人工構建的。與天然質粒相比,質粒載體通常帶有一個或一個以上的選擇性標記基因(如抗生素抗性基因)和一個人工合成的含有多個限制性內切酶識別位點的多克隆位點序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量盡可能減少,以便于基因工程操作。大多質粒載體帶有一些多用途的輔助序列,這些用途包括通過組織化學方法肉眼鑒定重組克隆、產生用于序列測定的單鏈DNA、體外轉錄外源DNA序列、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達等。一個理想的克隆載體大致應有下列一些特性：（1）分子量小、多拷貝、松馳控制型；（2）具有多種常用的限制性內切酶的單切點；（3）能插入較大的外源DN***段；（4）具有容易操作的檢測表型。常用的質粒載體大小一般在1kb至10kb之間，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（簡稱pBS）等。

　　從細菌中分離質粒DNA的方法都包括3個基本步驟:培養細菌使質粒擴增；收集和裂解細胞;分離和純化質粒DNA。采用溶菌酶可以破壞菌體細胞壁,十二烷基磺酸鈉(SDS)和Triton X-100可使細胞膜裂解。經溶菌酶和SDS或Triton X-100處理后,細菌染色體DNA會纏繞附著在細胞碎片上,同時由于細菌染色體DNA比質粒大得多,易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當用強熱或酸、堿處理時，細菌的線性染色體DNA變性,而共價閉合環狀DNA(Covalently closed circular DNA，簡稱cccDNA)的兩條鏈不會相互分開，當外界條件恢復正常時，線狀染色體DN***段難以復性,而是與變性的蛋白質和細胞碎片纏繞在一起,而質粒DNA雙鏈又恢復原狀,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解狀態存在于液相中。

在細菌細胞內,共價閉環質粒以超螺旋形式存在。在提取質粒過程中，除了超螺旋DNA外，還會產生其它形式的質粒DNA。如果質粒DNA兩條鏈中有一條鏈發生一處或多處斷裂,分子就能旋轉而消除鏈的張力,形成松馳型的環狀分子,稱開環DNA(Open circular DNA, 簡稱ocDNA)；如果質粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂,則形成線狀DNA(Linear DNA)。當提取的質粒DNA電泳時,同一質粒DNA其超螺旋形式的泳動速度要比開環和線狀分子的泳動速度快。

上一篇：抗生素藥敏紙片中英文對照表

下一篇：DNA提取的材料、設備及試劑