一 目的基因的克隆(以pshuttle-CMV質粒為例)
1. 選擇適當酶切位點,進行酶切連接,將目的片段插入pshuttl-CMV質粒多克隆位點。
2. 重組質粒鑒定: 酶切鑒定或測序。
3. 重組質粒擴增,純化并準備適量含目的基因的穿梭質粒。
4. 用PmeI單酶切線性化重組穿梭質粒,電泳鑒定質粒完全被切開。
5. 膠回收線性化質粒,以備共轉化使用。
二 共轉化
1 大腸桿菌BJ5183電轉感受態制備
從新鮮瓊脂板上挑取單個BJ5183細菌,接種于LB培養基中,
接種25ml過夜培養物于500ml LB培養基,
迅速將培養物置于冰浴中30min,至充分冷卻。
將菌液轉移至預冷的離心管中,
以10ml預冷的10%甘油洗滌沉淀,低溫離心,共兩次。
2 病毒骨架質粒轉化大腸桿菌,擴增,純化。
3 將1-5µl (約1µg) 線性化的穿梭質粒及1µl(約100ng/µl)病毒骨架質粒(如pAdEasy-1)加入至含約40µl BJ5183電轉感受態的EP管中混勻,冰上冷卻。
4 將混合物加入電轉杯,電擊(1250-1500V/mm,5ms)。
5 電擊結束取出樣品,加入1ml SOC或LB培養液,
6 取適當體積的電擊轉化細胞液涂于數個卡那霉素抗性平板(25-50mg/ml),
7 次日挑取平板上長出的菌落(選擇最小的菌落),接種于3ml含25-50mg/ml的LB培養基,
8 堿裂法提取質粒,0.8%瓊脂糖凝膠電泳篩選,大質粒為可能陽性克隆,進一步酶切鑒定。以PacI單酶切,0.8%瓊脂糖凝膠電泳如顯示出一條大片段(約30kb),及一條小片段(約3.0或4.5kb)(同時可進行其它酶切鑒定),則基本確定為陽性克隆。
9 取1-5µl 陽性質粒轉化至DH5α大腸桿菌細胞(BJ5183為recA+,質粒DNA易發生突變,DH5α或JM109,XL1-blue菌株為重組缺陷性菌株,可穩定擴增已鑒定的重組質粒),擴增細菌并純化質粒。
三 重組病毒質粒轉導293細胞
1 293細胞培養:轉導24小時前,以方瓶為例,接種2×106 293細胞于
2 以PacI單酶切重組病毒質粒(轉導
3 脂質體包裹質粒(以Lipofectamine為例):每4µg PacI約需20µl Lipofectamine包裹.質粒及脂質體分別稀釋于500µl無血清培養基再混合,置于室溫下15-30min。
4 以無血清培養基輕輕洗滌培養瓶,另加2.5ml無血清培養基,
5 將Lipofectamine-DNA混合物加入培養瓶,
6 4hr后,棄Lipofectamine-DNA混合液,另加入6ml DMEM完全培養基(含10% FCS)。如有大量細胞漂浮,可不棄Lipofectamine-DNA液,加入6ml DMEM完全培養基,
7 培養過程中觀察細胞生長情況。約2周后可觀察到細胞病變(CPE)出現(如用pAdTrack-CMV質粒,由于含GFP,可觀察到綠色熒光)。
四 重組病毒鑒定
1 轉導10-14d后,收集細胞沉淀,加入2ml滅菌的PBS混懸,凍融細胞,離心后收集上清保存于
2 取30-50% 步驟1中上清,感染50-70%飽和度的
3 感染后3-5d,當1/3-1/2細胞漂浮時收集病毒。按步驟1收集細胞并準備病毒上清。通過Western blot和/或PCR鑒定重組腺病毒產生。
4 PCR鑒定重組病毒。取5µl病毒上清加入10µl蛋白酶K,
五 重組病毒擴增,純化
1
2 以滅菌PBS重懸沉淀,反復凍融4次。
3 CsCl連續梯度離心純化:50ml離心管中稱量
(也可CsCl不連續梯度離心:20ml超速離心管中緩慢加入8ml CsCl 1.4 (
4 病毒透析去鹽:配置透析液(
六 病毒滴度測定(TCID50)
1 細胞準備:96孔板中接種100µl 293細胞,每孔細胞數約104個,以2% DMEM培養
2 稀釋病毒液準備:以2% DMEM將病毒液稀釋成8個較高濃度(如
3 10d后觀察細胞,記數每排出現CPE的孔數,計算細胞病變率。(如某一濃度各孔細胞全部病變,比率為1,如無細胞病變,則比率為0)。
4 計算T =10×101 + d (S - 0.5) /ml
d = Log 10 稀釋度(如為10倍稀釋℃,d=1)
S = 各濃℃細胞病變比率之和
實驗室重組腺病毒常用質粒:病毒骨架質粒:pAdEasy-1, pAdEasy-2
穿梭質粒:p-Shuttle, p-Shuttle-CMV, pAdTrack, pAdTrack-CMV
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