目的要求

1．掌握細菌抹片的制備方法和幾種常用的染色方法。

2．認識革蘭氏染色的反應特性。

操作步驟

??染色是細菌學上一個重要而基本的技術。由于細菌個體微小，且半透明，如不經染色往往不易識別。因此，借助于染色法可使細菌著色，與背景形成鮮明的對比，便于在顯微鏡下進行觀察。也可根據不同的染色反應，作為鑒別細菌的一種依據。

一、載玻片處理

載玻片應清晰透明，清潔而無油漬，滴上水后，能均勻展開，附著性好，如有殘余油漬，可按下列方法處理。

（一）滴上95％酒精2～3滴，用清潔紗布擦拭，然后以鐘擺速度通過酒精燈焰3～4次。

（二）若上法仍未能除去油漬，可再滴上1～2滴冰醋酸，用紗布擦凈，再在酒精燈火焰上輕輕拖過。

玻片潔凈后，用玻璃鉛筆在預涂材料處的背面劃一個直徑1.5cm的圓圈，用以標記。

二、涂片方法

（一）菌落涂片方法  涂片時，左手握菌種管，右手持接種環（又稱鉑金耳）取1～2??環生理鹽水，置于載玻片上，然后將接種環在火焰上滅菌，待冷后，從菌種管內釣取少許菌落，置于生理鹽水中混勻，涂成直徑1.5cm的涂膜，此膜既薄又均勻為好，待干即成。

（二）菌液涂片法  用滅菌接種環沾取菌液（液體培養物、血清、乳汁、組織滲出液等）1～2接種環，均勻涂抹在載玻片上,使成直徑為1.5cm左右圓形或橢圓形涂膜，自然干燥后備用。

（三）血液涂片方法  先取一張干凈無油垢邊緣整齊的載玻片，其一端沾取少許血液，以45度角放在另一張干凈無油垢的載玻片一端，從這端向另一端推成薄而均勻的血膜，待干后備用。

（四）組織涂片方法  先用鑷子夾持組織局部，然后以滅菌剪刀剪取一小塊，夾出后以其新鮮切面在載玻片上壓印或涂成一薄層。

三、干燥

?涂片最好在室溫中自然干燥。必要時，可將標本面向上，在離酒精燈火焰遠處烘干，切勿緊靠火焰，以免標本糊焦而不能檢查。

四、固定

有兩種固定方法

（一）火焰固定  ?將已干燥好的抹片，使涂面向上，以鐘擺速度通過酒精燈火焰四次，使固定后的標本觸及皮膚時，稍感燒燙為度。放置冷卻后，進行染色。

（二）化學固定  血液、組織臟器等抹片作姬姆薩氏染色或單染色時，不用火焰固定而用甲醇固定，可將已干燥的抹片浸入甲醇中2～3分鐘，取出晾干；或者在抹片上滴加數滴甲醇使其作用2～3分鐘后，自然揮發干燥，抹片作瑞特氏染色時則不必作特別固定，染色液中含有甲醇可以達到固定目的。

抹片固定的目的是：

1．使菌體蛋白凝固附著在載玻片上，以防染色過程中被水沖掉。

2．改變細菌對染料的通透性，因活細菌一般不允許染料進入細菌體內。

3．能殺死抹片中的部分微生物。

??必須注意，在抹片固定過程中，實際上并不能保證殺死全部細菌，也不能完全避免在染色水洗時不將部分涂抹物沖掉。因此，在制備烈性病原菌，特別是帶芽胞的病原菌抹片和染色時，應嚴格處理染色用過的殘液和抹片本身，以免引起病原的散播。

五、幾種常用的染色方法

（一）單染色法  只應用一種染料進行染色的方法，如美藍染色法。

美藍染色法：在已干燥、固定好的抹片上，滴加適量的（足夠覆蓋抹片點即可）美藍染色液，經1～2分鐘，水洗，瀝去多余的水分，吸干或烘干（不能太熱），然后鏡檢。

（二）復染色法  ??應用兩種或兩種以上的染料或再加助染劑進行染色的方法。染色時，有些是將染料分別先后使用，有些則同時混合使用，染色后不同的細菌和物體或者細菌結構的不同部分，可以呈現不同顏色，有鑒別細菌的作用，又可稱為鑒別染色，如革蘭氏染色法，抗酸染色法，瑞特氏染色法和姬姆薩氏染色法等。

1．革蘭氏染色法

（1）在已干燥，固定好的抹片上，滴加草酸銨結晶紫染色液，經1～2分鐘，水洗。

（2）加革蘭氏碘液于抹片上媒染，1～3分鐘，水洗。

（3）加95％酒精于抹片上脫色，約30秒至1分鐘，水洗。

（4）加10倍稀釋石炭酸復紅液復染1～2分鐘，水洗。

（5）吸干或烘干，鏡檢。革蘭氏陽性細菌呈藍紫色，革蘭氏陰性細菌呈紅色。

2．抗酸染色法

（1?）在已干燥，固定好的抹片上滴加較多量的石炭酸復紅染色液，將玻片置酒精燈火焰上緩緩加熱，至產生蒸汽即止（不要煮沸），維持微微產生蒸汽，經3～5分鐘，水洗。

（2）用3％鹽酸酒精脫色，直至標本無顏色脫出為止，充分水洗。

（3）用美藍染色液復染約1分鐘，水洗。

（4）吸干或烘干，鏡檢。抗酸性細菌呈紅色，非抗酸性細菌呈藍色。

3．瑞特氏染色法

抹片自然干燥后，滴加瑞氏染色液于其上，為了避免很快變干，染色液可稍多加些，或者看情況補充滴加，經1～3分鐘，加約與染液等量的中性蒸餾水或磷酸鹽緩沖液，輕輕晃動玻片，使與染液混勻，經3?分鐘左右，直接用水沖洗（不可先將染液傾去），吸干或烘干，鏡檢。細菌染成藍色，組織、細胞等呈其他顏色。

4．姬姆薩氏染色法

（1）于5ml新煮過的中性蒸餾水中滴加5～10滴姬姆薩氏染色液原液，即稀釋成為常用的姬姆薩氏染色液。

（2）抹片經甲醇固定并干燥后，在其上滴加足量的染色液或將抹片浸入盛有染色液的染色缸中，染色30分鐘，或染色數小時至24小時，取出水洗，吸干或烘干，鏡檢。細菌呈藍青色，組織、細胞等呈其他顏色。視野常呈淡紅色。

5．莢膜染色法

（1）涂片、干燥  同單染色法。

（2）固定  滴加甲醇液于涂抹面上，固定2～3分鐘。

（3）水洗  傾去甲醇液，用水輕微沖洗。

（4）染色  滴加堿性美蘭染色液數滴于涂抹面上，染色2～3分鐘。

（5）水洗  傾去染色液，用水輕微沖洗。

（6）干燥，鏡檢  菌體染成藍色，莢膜染成粉紅色或無色。

莢膜染色的原理：莢膜染色主要用于炭疽桿菌病料的莢膜檢查。因為炭疽桿菌莢膜系由d-?谷氨酸組成的多肽所構成，而菌體的主要成分則為核蛋白，因二者著色力不同，染色水洗后，則可把莢膜上一部分染料沖洗掉，顏色變淡，故顯微鏡檢查時，在著色較深的菌體周圍看到一圈呈淡紫色的膜，即莢膜。又因堿性美蘭是一種多染性染料，故菌體染為藍色，莢膜則染成淡薔薇色。

6．芽胞染色法

（1）將有芽胞的材料作涂片、干燥、固定。

（2）將5％孔雀綠水溶液滴加于固定好的涂片上。

（3??）用木夾夾住載玻片在酒精燈火焰上加熱，使染料冒蒸汽（但不能煮沸），切勿使染料蒸干，必要時可添加少許染料。加熱時間從冒蒸汽時開始計算約4～5分鐘。

（4）傾去染色液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再退色為止。

（5）用0.5％沙黃水溶液復染1分鐘，水洗。

（6）干燥或烘干后，置油鏡觀察，芽胞呈綠色，菌體呈紅色。

7．鞭毛染色法之一

（1）涂片  取10～12小時的幼齡培養菌，用1％福爾馬林水溶液制成菌液，在37℃溫箱中固定24小時，涂抹于載玻片上。

（2）自然干燥，不固定。

（3）用下述染色液加溫染色30秒到1分鐘，然后靜置1～2分鐘。

（4）染色液配制

①0.5％苦味酸水溶液（加溫溶解后過濾）1.0ml。

②20％鞣酸水溶液（加溫溶解，不過濾）1.0ml。

③5％鉀明礬水溶液（加溫溶解后過濾）0.5ml。

④10％復紅酒精溶液（配制后7天過濾）0.5ml。

上述染色液在用前，按①、②、③、④的順序混合后，即可使用（染色液現配現用）。

（4）水洗、干燥、鏡檢。

（5）結果  菌體呈深紅色，鞭毛呈淡紅色。

8．鞭毛染色之二

（1）脫脂玻片的準備  要用新的或表面沒有磨損痕跡的玻片。先用洗衣粉煮10～15分鐘，取出玻片用清水洗凈，再放入洗滌液中浸泡24小時左右，取出后，用自來水和蒸餾水洗凈，再用95％酒精脫脂，用火焰燒去酒精，即可使用。如不立即使用，可在脫脂后放于干凈的盒中，或浸泡于95％酒精中，用前在火焰上燒去酒精，冷卻后使用。

（2）菌種  最好應用有冷凝水的新制瓊脂斜面接種，培養10～12小時應用。如所用菌種久未移植，最好在這種斜面上每天移植一次，連續移植2～3次后使用。

（3）染色液的配制

甲液： 

單寧酸??            5g

FeCl₃?             1.5g

蒸餾水??            100ml

15％福爾馬林      2.0ml

1％NaOH??          1.0ml

配好后，當天使用，次日效果差，第3天則不好用。

乙液： 

AgNO₃      2g

蒸餾水      100ml

待AgNO₃溶解后，取出10ml備用，再向余下的90mlAgNO₃??中滴入濃氨水，使之成為很濃的氫氫化銀，再繼續滴加氨水變為透明，直到重新形成的沉淀物又剛剛溶解為止。再將備用的10ml AgNO₃慢慢滴入，則出現薄霧，但輕輕搖動后，薄霧狀沉淀又消失，再滴入AgN0₃?，直到搖動后仍呈現輕微而穩定的薄霧狀沉淀為止。如所呈薄霧不重，即可使用，此染劑可使用一周。如霧過重、則銀鹽被沉淀出，不宜使用。

（4）染色方法  ??在載玻片一端加蒸餾水一滴，再用接種環釣取少量細菌于水滴中沾幾下，將載玻片傾斜，使水滴流到另一端，然后將載玻片稍斜或平放，在空氣中干燥后，在涂片上滴加甲液染色2～4分鐘，用蒸餾水沖洗，將殘水甩干，或用乙液沖去水后，再加乙液染色30～60?秒鐘，然后用蒸餾水沖洗，在空氣中晾干，鏡檢。如未見鞭毛，應在整個涂片上多找幾個視野，有時只在部分涂片上染出鞭毛來。如加乙液后，將載玻片在酒精燈上稍加熱，使其微冒蒸汽且不干，則效果更好。

9．立克次氏體染色法

（1）涂片  以病料制成涂片。

（2）干燥、微加溫固定。

（3）染色  滴加0.25％堿性復紅水溶液（染色液調至pH7.2～7.4），用濾紙過濾,染色4分鐘。

（4）脫色  用0.5％枸櫞酸把多余的染色液洗脫掉。

（5）水洗

（6）復染  1％美蘭水溶液復染數秒鐘。

（7）水洗、干燥、鏡檢。

（8）結果  立克次氏體呈紅色，其他組織細胞呈藍色。

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