阿維菌素試驗方案
錄入時間:2011-8-12 15:13:54
來源：生物在線
培養基
（1）斜面和分離培養基(g／L)：可溶性淀粉10，(NH4)2SO4 2．5，NaC1 0．6，MgSO ·7H2O 1．2，K2HPO4·3H2O 3．0，CaCO3 3．0，瓊脂粉 20，pH 7．2～7．4，用蒸餾水配制。
種子培養基(g／L)：玉米淀粉25，花生餅粉1O，黃豆餅粉8．0，酵母粉5．0，酵母膏5．0，玉米漿4．0，CoCl2·6H2O 0．003，淀粉酶0．0025，pH7．O～7．2．用自來水配制。
發酵培養基(g／L)：玉米淀粉7O，花生餅粉1O，黃豆餅粉8．0，酵母粉5．0，酵母膏3．0，玉米漿2．2，CoCl2·6H2O 0．003，淀粉酶0．0025，pH7．O～7．2．用自來水配制。
（2）見筆記本
培養方法
從平板上挑取灰色豐滿的單菌落，轉接于斜面，28℃培養7～9 d．待長出豐富的灰色孢子后，轉接于種子培養液，220 r／min，28℃搖床培養28～30 h，接種5％于發酵培養液(250 ml三角瓶，裝50ml發酵液)，220 r／min，28℃搖床培養7～9 d，放瓶測定各指標。
3．誘導子制備
（1）藻多糖提取工藝
取海藻置于托盤放入恒溫培養箱低溫烘干，用電磨機打碎，使之成粉末狀。用天平稱取海藻粉50g放入500ml錐形瓶中加蒸餾水250ml放置于95℃水浴鍋中，并隔10min晃一次，4h后取出，冷卻到室溫。離心取上清液，在離心管中加無水乙醇，得到沉淀再次離心，取沉淀(多糖)，用蒸餾水沖洗數遍，于37度烘箱中烘干所得沉淀為粗多糖。
（2）1 多糖提取工藝紫菜一粉碎一紫菜干粉(40目)(加水(40-50倍)一微波加熱浸提-粗濾-離心(4000r/min,10min )-濃縮-45℃真空千燥一紫萊多糖（微波功率200w，加熱時間8min，水與紫菜液固重量比為50:1）
2 多糖含量的分析方法還原糖的測定:采用3.5一二硝基水楊酸比色法[51.總糖含量的測定:采用苯酚一硫酸比色法，以葡萄糖為標準品
3 紫菜多糖的計算多糖含量(%)=0.9x(總糖百分含量一還原糖百分含量)X100%，其中0.9是多糖的換算系數;紫菜多糖提取率(%)=紫菜多糖的含量/紫菜原料的質量x 100%.
（3）將用來制備誘導子的6種微生物分別接種到相應的液體培養基中進行搖床振蕩培養．其中，粗糙脈孢菌、紫紅曲霉在馬鈴薯葡萄糖液體培養基中25℃培養7 d；擲孢酵母、深紅酵母在麥芽汁液體培養基中25℃培養3 d；N89在營養肉湯培養基中28℃ 培養5 d；A05在蛋白胨查氏液體培養基中28℃ 培養10 d、分別收集培養好的菌體細胞，按Ayers 方法來制備誘導子．取2 g(濕重)的菌體細胞，用蒸餾水、100 mmol／L和500 mmol／L(pH 7．2)的PBS緩沖液分別洗滌2次，超聲破碎細胞，離心收集沉淀，沉淀再用500 mmol／L(pH 7．2)的PBS緩沖液和蒸餾水分別離心(4 000 r／min，5 min)洗滌8次，并重懸于蒸餾水中，0 1 MPa滅菌20 min后，置一20℃ 下儲存備。
4. 效價測定
（1）層析法分離純化，HPLC 法測定效價(任超，馬珦玻.阿維菌素B1a組分高產菌株誘變育種。生物技術通報，2005，4)
取發酵液5 ml，3 000 r／min，離心10 min，棄上清。加入丙酮2 ml，在旋渦式混合器上振蕩1 min，靜置10 min，重復3次。加入乙酸乙酯3 ml，振蕩1 min，3 000 r／min，離心10 min，上清液備用。
吸取4Oμl上清液點樣于GF254硅膠板上，然后層析。展層劑為：乙酸乙酯：三氯甲烷：二氯甲烷：無水:甲醇=9：9：2：1。層析后在紫外燈下觀察，將斑點處硅膠刮入離心管中，加入2 ml無水甲醇，在旋渦式混合器上振蕩1 min，靜置10 min后3 000 r／min，離心10 min。
HPLC分析采用C18反向柱，流動相為無水甲醇：水=85：15，流速1 ml／min，檢測波長244．6 nm。準確吸取5．0μl樣品濾液進樣，根據各組分的峰面積，對照標準曲線計算其含量，各組分之和即為總發酵單位。
（2）紫外分光光度法(對于斜面培養物)( 于秀蓮，何建勇，白秀峰. 阿維菌素產生菌的誘變育種. 沈陽藥科大學學報, 第21卷第3期)
將適量的斜面培養物鏟出置于離心管中，加入丙酮2 mL，浸泡后再加入乙酸乙酯2 mI ，在旋渦式混合器上震蕩2 min，3 000 r／min離心10 min，所得萃取液在754紫外分光光度計波長244 nm下，以甲醇為對照，測定樣品的光密度，根據預先制備的光密度一阿維菌素標準曲線，計算阿維菌素的效價。
（3）HPLC 法（同上）
色譜柱為kromasil Cl8(200 mm×4．6 ram)，流動相為甲醇-水(80：20)，流速1 mL/min。
取發酵液7 mL于離心管中。3 000 r/min離心10 min，棄去上清液。加入丙酮2 mL。在旋渦式混合器上震蕩2 min，靜置10 min，再加入乙酸乙酯5 mL，震蕩2 min，再以3 000 r/min離心10 min，得萃取液，用0．45 m的微孔濾膜過濾，準確吸取5．0 μl樣品濾液進樣，根據峰面積值進行計算
5．菌絲量（細胞干重），pH值
6．糖耗
總糖的測量：采用苯酚-硫酸比色法，以葡萄糖為標準品。
殘糖含量：采用3、5一二硝基水楊酸比色法。
7．電鏡、細胞膜通透性
8．活性氧(ROS)
9．質譜對比分析代謝物組變化
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