細胞的制備
應用細胞種類很多,茲以原代豬腎細胞為例。
(一)無菌取胚胎或仔豬腎。
(二)去腎被膜,切開腎為兩半,剪去腎盂及髓質部。
(三)以含青霉素各200單位/ml的磷酸鹽緩沖鹽水洗去血球,用剪刀剪成約小米粒大的小塊,移于滅菌三角瓶中。
(四)再用含抗菌素的磷酸鹽緩沖液洗3~4次至洗液徹底清亮為止。
(五)加入3~4倍以上體積的
亦可將組織塊在
(六)末次離心后,棄上液,加入少許營養液懸浮,用計算白血球的方法計算每毫升中細胞數,計數發現細胞太多時可取少許濃細胞液加營養液適當稀釋后再計。
營養液:取10 ml小牛血清,80ml漢克斯氏液和10 ml 5%乳蛋白水解物配成營養液,加雙抗使每ml營養液中含青、鏈霉素各200單位。青、鏈霉素事先可配成各20000單位/ml的溶液。
(八)分裝于小玻瓶(小型實驗室可用空的鏈霉素瓶,洗凈,滅菌)中,鏈霉素瓶裝1ml,并以蠟筆作瓶的上下記號。
平放靜置
(九)換液加病毒
長成單層后,吸棄營養液,加入9ml維持液。維持液中血清含量比營養液少一半(抗菌素含量同上)。接種含病毒的材料0.1ml,放回溫箱再培養。
(十)觀察及收獲病毒 每日檢查一次,凡有霉菌及細菌生長者棄之。病毒在其中生長,可引起細胞變性,原生質出現顆粒狀,核濃縮或裂解,有的還明顯的引起細胞溶解,出現空斑。發現有細胞變化或空斑時,即可將液體收集保存,同時做無菌檢驗。所收集的液體即繁殖的病毒液。有的病毒在細胞培養上生長,但細胞不出現病變,此時應以其它方法檢查,如回歸動物、END法、熒光抗體檢查等等。
瓶上細胞檢查可作為一個標本保存,即吸去內溶液以后,經甲醇固定,姬姆薩液染色,水洗,干燥后保存。
傳代細胞比初代細胞易于操作,在玻璃器皿內更易于適應,其性能(如所用的或可用的培養液、細胞的形態、細胞生長速度、細胞的保存等)是知道的,故較原代細胞常用。獸醫實驗診斷室最好備有傳代細胞,以便于從事病毒病的微生物學診斷。
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