真菌分離培養應考慮所分離真菌的特性,配制合適的培養基,選擇所需的氣體環境。同時, 由于真菌分離材料常污染有大量細菌,所以可在培養基中加入抗菌素并在分離培養過程中嚴格執行無菌操作。
目的要求
1.掌握真菌分離培養方法。
2.認識真菌菌落的特征,比較與細菌菌落有何不同。
3.了解真菌載片培養法。
4.掌握觀察真菌的基本方法,并觀察其形態特征。
操作步驟
—、真菌的分離培養方法
(-)平板劃線分離法
1.取適合真菌的瓊脂培養基融化,冷至
2.取要分離的材料(如田土、混?雜的或污染的真菌培養物、真菌)少許,投入盛無菌水的試管內,振搖,使分離菌懸浮于水中。
3.將接種環經火焰滅菌并冷卻后,蘸取上述菌懸浮液,進行平板劃線(同細菌的劃線法)。
4.劃線完畢,置溫箱中培養2~5d,待長出菌落后,釣取可疑單個菌落先作制片檢查,若只有一種所需要的真菌生長,即可進行釣菌純培養。如有雜?菌可從單個菌落中釣少許菌制成懸液,再作劃線分離培養,有時需反復多次,才得純種。另外,也可在放大鏡的觀察下,用無菌鑷子夾取一段?待分離的真菌菌絲,直接放在平板上作分離培養,可獲得該種真菌的純培養。
(二)稀釋分離法
1.取盛有無菌水的試管5支(每管9ml),分別標記1、2、3、4、5號。取樣品(如田土等)
2.用1ml滅菌吸管,按無菌操作法,從1號管中吸取1ml懸浮液注入2號管中,并搖勻;同樣由2號管取1ml至3號管,依此類推,直至5號管。注意每稀釋一管應更換一支滅菌吸管。
3.用2支無菌吸管分別由4號、5號試管中各取1ml懸液,并分別注入2個滅菌培養皿中,再加入融化后冷至
二.真菌培養性狀觀察
(一)真菌在固體培養基上的生長表現
1 .酵母菌菌落:酵母菌在固體培養基上??多呈油脂狀或蠟脂狀,表面光滑、濕潤、黏稠,有的表面呈粉粒狀、粗糙或皺褶。菌落邊緣有整齊、缺損或帶?絲狀。菌落顏色有乳白色、黃色或紅色等。
2. 霉菌菌落:將不同霉菌在固體培養基上培養2~5d,可??見霉菌菌落呈絨毛狀、絮狀、?蜘蛛網狀等。菌落大小依種而異,有的能擴展到整個固體培養基,有的有一定的局限性(直徑1~
(二)真菌在液體培養基中的生長表現
1. 酵母菌 注意觀察其混濁度、沉淀物及表面生長性狀等。
2. 霉菌 霉菌在液體培養基中生長,一般都在表面形成菌層,且不同的霉菌有不同的形態和顏色。
三. 真菌的形態觀察
(一)真菌水浸片的制備及觀察
常用美蘭染色液制備真菌水浸片來觀察真菌的菌體形態,并且活細胞能還原美藍為無色,故可區?別死細胞、活細胞。
1. 酵母菌水浸片的制備
將美蘭染色液一滴滴加在干凈的載玻片中央,如不染色則加蒸餾水一滴,用接觸環以無菌操作取培養48h左右??的酵母菌體少許,在液滴中輕輕涂抹均勻(液體培養物可直接取一接種環培養液于玻片上)??并加蓋干凈蓋玻片。為避免產生氣泡,應先將其一邊接觸液滴,再慢慢放下蓋片。然后置于顯微鏡載物臺上進行觀察,注意酵母菌的形態、大小和芽體,同時可以根據是否染上顏色來區別死、活細胞。
2. 霉菌水浸片的制備
在干凈載玻片上加蒸餾水或美蘭染色液一滴。取培養2~5d的根霉或毛霉、培養3~5d的曲霉、青霉或木霉、培養2d左右的白地霉同上法制片。霉菌要選擇有無性孢子的菌??體,用解剖針挑取少量菌絲體放在載玻片的液滴中,將玻片置于解剖鏡下,細心地用解剖?針將菌絲體分散成自然狀態,然后加蓋玻片,注意不要讓其產生氣泡,蓋后不再移動玻片,以免弄亂菌絲。制好片后,就可以在顯微鏡下觀察。
觀察時注意它們的菌絲有無隔膜、孢子囊柄與分??生孢子柄的形狀、分生孢子小梗的著生方式、孢子囊的形態、足細胞與假根的有無、孢子囊孢子和分生孢子的形狀和顏色、節孢子的形狀和特點等。并且要區別根霉與毛霉、青霉、曲霉、木霉之間的異同點以及白地霉的特點。
(二)霉菌封閉標本的制備
霉菌的封閉標本,常用乳酸石炭酸??液封片,其中含有的甘油使標本不宜干燥,而石炭酸又有防腐作用。在封片液中,還可加入棉藍或其它酸性染料?,以便于觀察菌體。
在潔凈載玻片上滴一滴乳酸石炭酸棉藍染色液,用解剖針從霉菌菌落的邊緣處取少許帶有孢子的菌絲于染液中,再細心地把菌絲挑成自然?狀態,然后用蓋玻片蓋上,注意不要產生氣泡。在溫暖干燥室內放數日,讓水分蒸發一部?分,使蓋玻片與載玻片緊貼,即可封片。封片時,先用清潔的紗布或脫脂棉將蓋玻片四周擦凈,并在蓋玻片周圍涂一圈加拿大樹膠或合成樹膠,風干后即成封閉標本。
(三)真菌的載片培養
取直徑
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