需氧性細菌分離培養法

1. 平板劃線分離法

菌種被其他雜菌污染時或混合菌懸液常用平板劃線法進行純種分離，此法是借助將蘸有混合菌懸液的接種環在平板表面多方向連續劃線，使混雜的微生物細胞在平板表面分散，經??培養得到分散的由單個微生物細胞繁殖而成的菌落，從而達到純化目的。 但劃線分離的培養基必須事先傾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才可使用；為便于劃??線，一般培養基不宜太薄，每皿約傾倒20 ml培養基，培養基應厚薄均勻，平板表面光滑。劃線分離主要有連續劃線法（圖4-1）和分區劃線法（圖4-2）兩種。劃線法示意圖見圖4-3。

（1）連續劃線法

(2)分區劃線法（四分區劃線法）

取菌、接種、培養方法與“連續劃線法”相似。分區劃線法劃線分離時平板分4個區，故又稱四分區劃線法。其中第4區是單菌落的主要分布區，故其劃線面積應最大。為防止第4區內劃線與1、2、3區線條相接觸，應使4區線條與1區線條相平行，這樣區與區間線條夾角最好保持120度左右。先將接種環蘸取少量菌在平板上1區劃3-5條平行線，取出接種環，左手關上皿蓋，將平板轉動60～70度。灼燒接種環，待在平板邊緣上冷卻后，再按以上方法以1區劃線的菌體為菌源，由1區向2區作第2次平行劃線。第2次劃線完畢，同時再把平皿轉動約60～70度，同樣依次在3、4區劃線。劃線完畢，灼燒接種環，關上皿蓋，倒置于37℃恒溫箱中培養24h后，在劃線區觀察單菌落。

2. 傾注平皿分離法

被檢材料若含有兩種或兩種以上細菌時,可借助溶化的瓊脂將細菌稀釋，待瓊脂冷凝后,分散的細菌就被固定在原地形成菌落.這樣也能達到分得純種的目的。根據材料中存在菌數的多少，傾注平皿前可將被檢材料不稀?釋或用生理鹽水作適當稀釋。其具體方法如下：

取三支預先準備的普通瓊脂培養基試管，水浴加熱融化，冷至約50℃，用火焰滅菌接種環釣取待分離物接種至第一管內，充分搖勻后，自第一管取一接種環內容物至第二管，以同樣方法自第二管移種至第?三管。然后分別傾注一個已滅菌的平皿，凝固后倒??轉置于37℃溫箱內培養24h。結果多數細菌在瓊脂內生長成菌落，僅少數菌落出現在表面，通常第一個平板內的菌落數較多而密集，第二、三個平板則逐漸減少，可見單個????菌落。

3. 芽胞需氧菌分離培養法

如果被檢材料中可疑有帶芽孢的細菌，可先將被檢材料加少量生理鹽水或肉湯，置于80℃水浴箱中維持15～20分鐘，或85℃加熱10分鐘，再進行培養。材料中若有帶芽孢的細菌仍可存活而生長繁殖，不耐熱的細菌繁殖體則被殺滅。

4．利用化學藥品的分離培養法

（1）抑菌作用  有些藥品對某些細菌有極強的抑?制作用，而對另外一些細菌沒有抑制作用，所以可利用這種特性進行細菌的分離，例如通常在培養基中加入結晶紫或青霉素等化學藥品來抑制革蘭氏陽性菌的生長，以分離得到革蘭氏陰性??菌。

（2）殺菌作用  將病料如結核病料用15％硫酸溶液處理，其他雜菌均被殺死，而結核桿菌因具有抗酸性而存活。

（3）鑒別作用  利用細菌對某種糖的分解能力，通過培養基中指示??劑的變化來鑒別某種細菌。例如遠藤氏培養基可以用來鑒別大腸桿菌與沙門氏桿菌。

5. 實驗動物分離法

被檢病料中疑有某種病原菌存在，可將病料以無菌操作取出，放入滅菌乳缽或組織勻漿器內，加3～5倍量無菌生理鹽水制成混懸液，吸取一定量混懸液注射（肌肉、腹腔、皮下或靜脈）入易感實驗動物,待實驗動物死后，取其臟器，常可分離到純的病原菌。例如，疑??有豬丹毒桿菌存在的病料，可注射于鴿體，鴿死后，再取其脾臟以分離豬丹毒桿菌，可得到純培養。

6. 瓊脂斜面分離法

取瓊脂斜面3管，用接種環蘸取欲檢病料少許（如為臟器，先將表面燒烙后，用滅??菌解剖刀切開，以滅菌接種環由切口插入、轉動、釣取組織），混合于第1管的凝集水中，再作斜面劃線；然后抽出接種環，不經燒灼，繼續在第2管、第3管斜面上作同樣劃線。劃畢，置37℃溫箱中培養。經此法分離培養后，第2管的菌落較第1管為少，第3管的菌落更少，如此較易得到單個菌落，達到純培養之目的。

7. 瓊脂平板涂布分離法

被檢病料如血液、腹水等，可用滅菌毛細吸管或吸管吸取 1～2滴置于平板中央，用滅菌的L形玻棒作均勻涂布。?如估計細菌數很多，可直接用火焰滅菌的接種環釣菌，并做分區劃線。如為臟器病料，可先作成乳懸液再行涂布；或取其一小塊，用鑷子夾住，表面燒烙后，用滅菌刀切開，以其切面直接進行涂布，此法適用于含菌量較少的病料的分離。

8. 營養肉湯分離法

當組織病料中含病原菌少，或有抗菌藥殘留時，用上述瓊脂斜面或平板分離法可能無菌落長出，??這時可以無菌操作剪取一小塊病料直接投入肉湯，經37℃培養，在肉湯中長出細菌后，再用瓊脂斜面或瓊脂平板分離。

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