一、標本采集
支原體常侵及人和動物的粘膜表面，一般可用棉花拭子涂抹取樣后放入2~3ml支原體液體培養基的小管中，或取其分泌液，若標本是組織塊，可在滅菌乳缽或玻璃勻漿后接種，取樣后應盡快接種培養。
二、分離培養
1、支原體固體培養基接種法轉動拭子將標本液體盡量擠出，用無菌滴管吸1~2滴接種在平皿上蓋好，用L棒涂抹或傾斜轉動平皿使標本均勻分布，置37℃孵育。
2、支原體半固體培養基接種法混種法：在制備半固體培養基時，培養基加熱溶化，溫度降至50℃時，添加動物血清、酵母浸液及青霉素后混勻，待冷卻至37~40℃時，用無菌滴管吸取標本 0.5~1ml加入培養基中，充分混勻，凝固后置37℃孵育。
3、穿刺接種法：方法同細菌接種法。
三、結果觀察
絕大多數支原體為兼性厭氧，少數在含10% CO2和相對濕度80~90%的大氣環境中生長良好。支原體生長緩慢，多數于3~4d長出菌落，少數于1~2w方長出典型菌落，在平皿固體培養基上生長的菌落呈"油煎蛋"狀，邊緣不整齊。
四、附錄
糖酵解培養基（肺炎支原體培養基）
基礎培養基 70ml
馬（或牛血清） 20ml
25%酵母浸液 10ml
0.4%酚紅 0.5ml
1%醋酸鉈 2.5ml
青霉素10000IU/ml 5.0ml
調pH 7.8
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