三、制片和染色的基本程序
微生物的染色方法很多，各種方法應用的染料也不盡相同，但是一般染色都要通過制片及一套染色操作程序。
1、制片
在干凈的載玻片上滴上一滴蒸餾水，用接種環進行無菌操作，挑取培養物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成懸液并涂成直徑約1厘米的薄層，為避免因菌數過多聚成集團，不利觀察個體形態，可在載玻片之一側再加一滴水，從已涂布的菌液中再取一環于此水滴中進行稀釋，涂布成薄層，若材料為液體培養物或固體培養物中洗下制備的菌液，則直接涂布于載玻片上即可。
2、自然干燥
涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時為了使之干得更快些，可將標本面向上，手持載玻片一端的兩側，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標本烤枯而變形。
3、固定
標本干燥后即進行固定，固定的目的有三個：
１）殺死微生物，固定細胞結構。
２）保證菌體能更牢的粘附在載玻片上，防止標本被水沖洗掉。
３）改變染料對細胞的通透性，因為死的原生質比活的原生質易于染色。
固定常常利用高溫，手執載玻片的一端（涂有標本的遠端），標本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過3—4次，共約2—3秒鐘，并不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60℃）,放置待冷后，進行染色。
以上這種固定法在微生物實驗室中雖然應用較多普遍，但是應當指出，在研究微生物細胞結構時不適用，應采用化學固定法。化學固定法最常用的固定劑有：酒精（95%），酒精和醚各半的混合物，丙酮，1—2%的餓酸等。餓酸能很快固定細胞但不改變其結構，故較常用。應用餓酸固定細胞的技術如下：在培養皿中放一玻璃，在玻璃上放置玻璃毛細管，在毛細管中注入少量的1—2%餓酸溶液，同時在玻璃上再放置濕標本涂片的載玻片，然后把培養皿蓋上，經過1—2分鐘后把標本從培養皿中取出，并使之干燥。
4、染色
標本固定后，滴加染色液。染色的時間各不相同，視標本與染料的性質而定，有時染色時還要加熱。染料作用標本的時間平均約1—3分鐘，而所有的染色時間內，整個涂片（或有標本的部分）應該浸在染料之中。
若作復合染色，在媒染處理時，媒染劑與染料形成不溶性化合物，可增加染料和細菌的親和力。一般固定后媒染，但也可以結合固定或染色同時進行。
5、脫色
用醇類或酸類處理染色的細胞，使之脫色。可檢查染料與細胞結合的穩定程度，鑒別不同種類的細菌。常用的脫色劑是95%酒精和3%鹽酸溶液。
6、復染
脫色后再用一種染色劑進行染色，與不被脫色部位形成鮮明的對照，便于觀察。革氏染色在酒精脫色后用番紅，石碳酸復紅最后進行染色，就是復染。
7、水洗
染色到一定的時候，用細小的水流從標本的背面把多余的染料沖洗掉，被菌體吸附的染料則保留。
8、干燥
著色標本洗凈后，將標本晾干，或用吸水紙把多余的水吸去，然后晾干或微熱烘干，用吸水紙時，切勿使載玻片翻轉，以免將菌體擦掉。
9、鏡檢
干燥后的標本可用顯微鏡觀察。
綜上所述，染色的基本程序如下：
制片→固定→媒染→染色→脫色→復染→水洗→干燥→鏡檢。
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