炭疽桿菌檢驗
 Bacillus anthracis

 

一、炭疽桿菌與炭疽病

n炭疽桿菌(Bacillus anthracis)：人類最早認識和注意的重要病原菌之一，是炭疽病的病原體。

n炭疽病(Anthrax)是一種人獸共患的急性、熱性、敗血性烈性傳染病，呈世界性分布。一年四季均可發生，以夏、秋季節較高。其易感動物之多，僅次于狂犬病。

n家畜中以牛和綿羊最易感，常呈超急性、急性經過，表現為突然倒地，呼吸困難，全身痙攣，高熱，可視黏膜發紺，天然孔出血，血凝不良，尸僵不全；山羊、馬、驢、騾、水牛、駱駝次之；豬有較強抵抗力，常呈慢性經過，表現為咽唊炎型、腸型和肺型。    炭疽：血液呈煤焦油狀

n人類常因食用帶有該菌的食物、飲水或與患炭疽死亡的動物及其畜產品接觸而通過消化道、呼吸道或皮膚粘膜而感染，表現為皮膚、肺、縱隔及腸道的急性感染，有時伴有炭疽桿菌敗血癥。腸型炭疽和肺型炭疽常表現為急性敗血癥經過，病死率很高。1923～1940年前蘇聯爆發6次腸型炭疽，其中最嚴重的一次是由病畜肉制成的臘腸引起的，27例病人無一幸存。

n本菌可通過患病動物血液、分泌物、排泄物，或死亡病畜的尸體、組織、臟器、體液、骨骼、皮毛等污染土壤、空氣、江河、池塘甚至食物和飲水，尤其是病畜的血液，可以成為感染人類、污染環境的重要來源。

n炭疽桿菌繁殖體的抵抗力不強，但其所形成的芽孢對外界環境的抵抗力極為強大，可長期存活。自然環境一旦被芽孢污染，則成為長久的疫源地而不易清除，長期危害人類和動物。因此，采取有效措施防止本菌的污染和傳播，在人獸共患病防治和食品衛生學方面具有重要意義。

Cutaneous anthrax vesicle development. Day 4: Black eschar, redness remains.

Cutaneous anthrax vesicle development. Day 4: Notice the edema and typical lesions.

 

二、生物學特性

(一)形態染色特性

n炭疽桿菌歸需氧芽孢桿菌屬，革蘭氏陽性粗大桿菌，大小為1.0～1.2µm ´ 3～5µm。無鞭毛，不能運動。在人和動物體內常呈單個散在或呈短鏈狀，菌體兩端平截，周圍形成粘液樣肥厚莢膜，似竹節狀。在血液、血清瓊脂平板上或加有碳酸氫鈉的瓊脂平板上，于10%～20% CO2環境中培養，也可形成莢膜。莢膜比菌體更耐腐敗，因此在腐敗組織中往往不見菌體而只見“菌影”(莢膜的輪廓)。在人工培養物內和自然界中，一般不形成莢膜，常呈長鏈狀。

n能形成卵圓形芽孢，芽孢位于菌體中央。形成芽孢的條件：氧氣充足、溫度適宜(25℃～30℃) 。

nAnthrax. Toluidine blue (甲苯胺藍)stain. Bacillus anthracis in a bovine spleen. Anthrax bacilli in tissue seen in short chains surrounded by a common capsule.

n Coloured scanning, electron micrograph (SEM) of anthrax bacteria (Bacillus anthracis), the cause of the disease anthrax in humans and livestock.

(二)培養特性

n本菌對營養要求不嚴格，在一般培養基上即可生長。生長溫度范圍14℃～44℃ ，最適溫度30℃～37℃。pH范圍6.0～8.5，最適pH7.2～7.6。

n普通瓊脂：強毒株18～24h形成扁平、粗糙、表面干燥、灰白色、不透明、邊緣不整齊的火焰狀菌落，在低倍顯微鏡下，可見菌落邊緣呈卷發狀，用接種針探觸，有粘滯感，挑之，可拉起絲。弱毒株或無毒株形成光滑菌落，菌落稍小而隆起，邊緣較整齊。

n普通肉湯：管底有絮狀沉淀物，整個培養液澄清，如輕輕搖動試管，可見沉淀物卷繞成團，往上升起。不形成菌膜或菌環。

n血瓊脂平板：菌落周圍無明顯的溶血環，但培養較久后可出現輕度溶血，菌落周圍不透明。菌落有粘性，用接種針釣取可拉成絲，稱為“拉絲”現象。

n明膠穿刺：只沿穿刺線生長，培養2～3d后明膠呈漏斗狀液化，上部向外擴展呈白色的倒立松樹狀。

(三)生化特性

n本菌能分解葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、菊糖、蕈糖和果糖，產酸不產氣；不分解乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、甘露醇、乳糖、甘露醇、山梨醇和衛茅醇；有些菌株可遲緩發酵甘油和水楊苷。

n不能利用枸櫞酸鹽；不分解尿素；能水解淀粉和乳蛋白；通常可還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；不產生靛基質和硫化氫，V-P試驗不定；苯丙氨酸脫氨酶和磷酸酯酶陰性，接觸酶陽性；牛乳經2～4d凝固，然后慢慢胨化。

Anthrax is an acute infectious disease caused by the bacterium Bacillus anthracis. Anthrax is primarily a disease of domesticated and wild animals, particularly herbivores such as cattle, sheep, horses, mules and goats.

B. anthracis was so called after the Greek word for black coal ('anthracis'), due to the black necrotic ulcers characteristic of cutaneous anthrax infection.

The bacterium produces spores which can survive dormant in the soil for many years and although human anthrax is fairly rare, infection occurs incidentally through contact with diseased animals or by inhaling anthrax spores from contaminated animal products such as flesh, bones, hides, hair and excrement.

(三)血清學特性

n目前已知有4種抗原成分：保護性抗原、莢膜抗原、菌體抗原和芽孢抗原。

1、保護性抗原：是炭疽桿菌生活過程中產生的一種細胞外蛋白質，為炭疽桿菌毒素的組成部分，有免疫原性，其相應的抗體能使動物抵抗本菌的感染作用。

2、莢膜抗原：由D-谷氨酰多肽組成，是一種半抗原，與毒力有關，僅見于有毒菌株；該抗原產生的抗體對動物無保護作用，但具有較特異的抗原性，由此建立起用于鑒定菌種的莢膜腫脹試驗和測定患者血清莢膜抗體的免疫熒光法等，均能獲得較好的效果。

3、菌體抗原：有2種。一種為多糖半抗原，存在于細菌細胞壁和菌體內，耐熱，比較穩定，與毒力無關；常用的炭疽沉淀反應(Ascoli反應)就是通過檢測此抗原而判定炭疽污染的；有種的特異性，但特異性不高，能與其它需氧芽孢桿菌等發生交叉反應。另一種是菌體蛋白質抗原，具有對細菌自身的保護作用。

4、芽孢抗原：位于芽孢的外膜，具有免疫原性和血清學診斷價值。

 

三、檢驗

(一)檢驗程序    見《動物性食品檢驗學》第六章。

(二)細菌學檢查

1.顯微鏡檢查：取待檢材料制成涂片，用莢膜染色法及革蘭氏染色法染色后鏡檢。革蘭氏染色可見G+ 粗大桿菌。莢膜染色法菌體呈深紫色，莢膜淡紫色；堿性美蘭染色可將菌體染成藍色，莢膜為淡粉紅色。

2.分離培養：一般分離培養采用血瓊脂平板。污染嚴重的標本，可在處理后接種于炭疽桿菌選擇性瓊脂平板，如戊烷脒血瓊脂平板。經37℃10h～24h培養后，進行菌落檢查和鑒別試驗。

在戊烷脒血瓊脂平板上，多數其它芽孢桿菌受到抑制，而炭疽桿菌仍可生長，但也受到輕度抑制。菌落生長較慢較小，不溶血，呈卷發狀。

3.鑒別試驗

(1)明膠穿刺：沿穿刺線形成白色的倒立松樹狀生長，可證實為炭疽桿菌。

(2)串珠試驗：在適當濃度的青霉素(0.05～0.5 IU/mL)作用下，炭疽桿菌細胞壁粘肽的合成被抑制，使菌體膨大，形成大而均勻的圓球狀，類似串珠。這種現象為炭疽桿菌所特有，可與其它需氧芽孢菌鑒別，且與常規檢查符合率高達80% ～90%。常用方法有肉湯法和瓊脂薄片法。

(3)串珠熒光抗體染色法：本法結合了串珠試驗和熒光抗體染色法的特點，具有雙重特異性，有助于與其它需氧菌的區別。

(三)其它檢驗方法        主要介紹如下幾種方法。

1. 莢膜熒光抗體染色法                                        

2. 莢膜腫脹試驗

3. Ascoli’s反應(環狀沉淀試驗)   該方法自1902年由Ascoli首次提出后，一直被廣泛應用，適用于疑似炭疽死亡動物的病料、干的皮張、陳舊及污染嚴重的炭疽病料等。但該法特異性和敏感性較差，因此其應用有一定局限性。

4. 乳膠凝集試驗

5. 青霉素抑制試驗    每1mL培養基中含青霉素10 IU時，可抑制炭疽桿菌的生長，而其它需氧芽孢桿菌生長不受影響。

6. 噬菌體裂解試驗