【摘要】  目的 研究鮑曼不動桿菌耐藥性與耐藥基因之間的關系 方法 用VITEK-2型全自動微生物分析儀,檢測331株鮑曼不動桿菌和42株 重耐藥菌的藥敏情況,用PCR方法檢測多重耐藥菌的耐藥基因。結果 鮑曼不動桿菌對21 抗生素的平均耐藥率分別 59.8%和62.8%；對頭孢曲松、頭孢唑啉和頭孢替坦的耐藥率均為100%； 42株多重耐藥菌株（100%）對頭孢曲松、頭孢呋辛鈉、頭孢呋辛酯、頭孢唑啉、頭孢替坦和氨芐西林完全耐藥,且均檢測有TEM-1和ampC基因;38株多重耐藥菌均檢測到TEM-1、ampC、aac（3）和gyrA型基因。結論鮑曼不動桿菌已成為醫院重要致病菌, 且多重耐藥率很高，與攜帶的TEM-1、ampC、aac（3）和gyrA型基因有關。

【關鍵詞】  鮑曼不動桿菌; 多重耐藥基因; 耐藥基因檢測

    Study on antibiotics resistance and resistant genes of Acinetobacter baumannii

    XU Jing-feng，XU-Lin ,FAN Wei-hong?.General Hospital of Beijing Military Command, Beijing 100700，China

    【Abstract】  Objective  Objective To study the relationship between antibiotic resistance and r??esistant gene of Acinetobacter baumannii.Met?hods  The antibiotic resistance and resistant gene was determined by polymerase chain reaction（PCR）and with WHONET5.0 in 331 strains and 42 strains multiresistance of Aci??netobacter baumannii.Results  The resistance rates of Acinetobacter baumannii to ceftriaxone、cefotetan 、cefazolin were100% and to Imipenem 、 meropenem were23.5%,38.3% respectively .42 strains were?? identified as multiresistant isolates with presence of TEM-1 and ampC ??gene;38 strains were identified as multiresistant isolates of TEM-1、ampC、aac（3） and gyrA gene.Conclusion  Th??e multiresistance of Acinetobacter baumannii has close relation to concomitant presence of TEM-1、ampC、aac（3） and gyrA gene.

    【Key words】  Acinetobacter baumannii;drug multiresistant;drug resistant gene detection

    鮑曼不動桿菌已成為醫院獲得性肺炎的重要致病菌,且很容易在監護病房流行。由于鮑曼不動桿菌在自然界的廣泛存在及其復雜的耐藥機制,對β內酰胺類、氨基糖苷類以及喹諾酮類抗生素已呈現多重耐藥，給臨床治療其所致感染帶來很 困難。為能 好地指導臨床選擇合適的抗生素，本文對本院2005～2006年住院患者標本分離的331株鮑曼不動桿菌進行藥敏分析,并對2006年分離的42株多重耐藥鮑曼不動桿菌的基因進行測序和研究,現報告如下。

    1  材料與方法

    1.1  菌株來源  331株鮑曼不動桿菌均為我院臨床標本中分離并按全國統 操作規程［1］。標本主要包括血液、尿液、痰和其他分泌物。

    1.2  儀器試劑  VITEK-2型全自動微生物分析儀、ID-GN 鑒定卡、AST-GN09藥敏卡由法國Bio-Merieux公司生產; VITEK 比濁計（V 1210） 由日本生產；PCR擴增儀為美國PERKIN ELMER公司9600型基因擴增儀；日本三洋MDF型超低溫冰箱;德國Hettich公司22R型低溫超速離心機;美國水套式恒溫培養箱。

    1.3  菌種鑒定、藥敏  所有實驗菌株分離純化后按VITEK-2的使用要求配制成菌懸液和稀釋液, 分別填充到ID-GN和AST-GN09卡中, 用VITEK-2儀器自動完成細菌的鑒定和藥敏實驗。

    1.4  質控菌株  由衛生部臨床檢驗中心提供的標準菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）, 藥敏質控結果符合NCCLS 藥敏質控要求。

    1.5  統計學處理［2］  細菌耐藥性分析用 WHONET5軟件進行分析，耐藥率顯著性差異用SPSS10.0統計軟件分析,兩組耐藥率比較應用χ2檢驗。

    1.6  耐藥基因的檢測  采用堿裂解法和蛋白酶K法提取被測細菌的質粒和染色體基因,提取方法根據不同引物設立不同PCR條件；以ATCC700603肺炎克雷伯菌和TEM-26型大腸埃希菌分別作SHV型和TEM型陽性對照；其余 ampC、PER-1、OXA-23基因陽性對照均為北京華明公司基因檢測室經基因測序后比對的陽性菌株。

    1.7  PCR耐藥菌基因［3］  根據GenBank提供的耐藥基因，采用Primer軟件設計引物（見表1）。反應體系均為25μl,其中緩沖液2.5μl,10mmol/L 4×dNTP 0.5μl,50μmol/上下游引物各1μl,DNA多聚酶0.25μl,DNA模板1μl,超純水18.75μl 。根據不同引物設立不同PCR反應條件。以ATCC700603肺炎克雷伯菌作SHV型陽性對照，以TEM-26型大腸埃希菌作TEM型陽性對照,產物經電泳,在紫外線下觀察結果,并在凝膠上成像。表1  用于檢測各種耐藥基因的引物（略）

    2  結果與分析

    2.1  鮑曼不動桿菌的臨床分布  本文鮑曼不動桿菌均來源于本院的住院病人，其中2006年160株,按標本分為血（6株）、痰（136株）、尿（6株）和其他分泌物12株；2005年171株, 按標本分為尿（5株）、痰（82株）和其他分泌物（89株）。

    2.2  鮑曼不動桿菌對常用5大類21種抗生素的藥敏結果  見表2。2006年和2005年鮑曼不動桿菌對21種抗生素的平均耐藥率分別為62.8%和59.8%，經χ2檢驗，差異無顯著性（P>0.05）。2006年鮑曼不動桿菌對頭孢曲松、頭孢唑啉和頭孢替坦的耐藥率均為100%；對頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢呋辛鈉和頭孢呋辛酯的耐藥率分別為57.7%、44.6%、98.0%和98.0%；對β內酰胺和碳青霉烯類如氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南的耐藥率分別為100%、48.3%、54.4%、17.7%和75.8%，對亞胺培南和美洛培南的耐藥率分別為23.5%和38.3%。2005年鮑曼不動桿菌對頭孢曲松和頭孢替坦的耐藥率均為100%；對頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢呋辛鈉、頭孢呋辛酯和頭孢唑啉的耐藥率分別為43.9%、37.2%、92.1%、92.1%和96.5%；對β內酰胺和碳青霉烯類如氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南的耐藥率分別為100%、49.5%、55.2%、15.2%和86.9%，對亞胺培南和美洛培南的耐藥率分別為28.9%和34.9%。2006和2005年鮑曼不動桿菌對呋喃妥因的耐藥率均為100%，對左旋氧氟沙星和環丙沙星的耐藥率分別為8.4%、21.5%和75.4%、54.4%。表2  鮑曼不動桿菌對抗生素的耐藥率 （略）注：2006與2005年的耐藥率比較，※P<0.05

    2．3  多重耐藥菌的藥敏結果  從2006年分離的42株多重耐藥鮑曼不動桿菌對18種抗生素的藥敏結果見表3。42株（100%）菌株對頭孢曲松、頭孢呋辛鈉、頭孢呋辛酯、頭孢唑啉、頭孢替坦和氨芐西林完全耐藥,35株（83%）菌株對氨曲南耐藥；25株（60%）菌株對亞胺培南敏感,23株（55%）菌株分別對哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素和美洛培南敏感,17株（40%）菌株對慶大霉素和哌拉西林敏感。

    2．4  耐藥基因檢測  在42株多重耐藥的鮑曼不動桿菌中,均檢測有TEM-1和ampC基因,5株（12%）檢測到ESBLs, 說明鮑曼不動桿菌對β- 內酰胺類抗生素有極高的耐藥性;38株（90%）多重耐藥菌均檢測到TEM-1、ampC、aac（3）和gyrA型基因;19株（45%）檢測有TEM-1、PER型基因。所有菌株均未檢出SHV、PER-1、VEB-1、IMP、VIM、OXA-23、OXA-24型基因（圖1）。表3  42株多重耐藥鮑曼不動桿菌的藥敏結果（略）

    2.5  測序結果  將PCR型陽性擴增產物做雙向基因測序,并與GenBank 據庫公布的相關基因序列進行比對分析, 所有與產超廣譜酶的目標基因（Z21957）的PCR產物同源性為100%;將OXA -23型PCR擴增陽性的4份標本產物做單向測序,結果與OXA -23產碳青霉烯酶基因（AF201828）序列的同源性達到99%； 另8份Ampc酶PCR陽性產物作單向測序,結果與染色體介導的高產Ampc酶目標基因（AJ009979） 的同源性為100%;6份gyrA型基因擴增產物測序與目標基因（X82165）比對顯示,在83位點的絲氨酸均被亮氨酸取代。

    3  討論

    3.1  本組鮑曼不動桿菌85%來自呼吸道標本，說明不動桿菌雖然是呼吸道的寄居菌，但在人體內成為優勢菌時，也能引起呼吸道感染，而且可導致多臟器、多系統感染,尤其容易發生于危急重癥病人。大量廣譜抗生素的應用,使耐藥的鮑曼不動桿菌得到優勢生長,也成了鮑曼不動桿菌肺部感染的危險因素。

    3.2  本組鮑曼不動桿菌對常用5大類 21種抗生素的平均耐藥率為59.8%和62.8%，對頭孢曲松等5 種頭孢菌素和氨芐西林的耐藥率幾乎達100%，對亞胺培南和美洛培南也有23.5%和38.3%的耐藥率，說明本組鮑曼不動桿菌產生了嚴重的多重耐藥性。

    3.3  本組鮑曼不動桿菌對氨芐西林/舒巴坦加酶抑制劑的耐藥率為48.3%和49.5%，明顯低于氨芐西林100%的耐藥率。對哌拉西林/他唑巴坦加酶抑制劑的耐藥率僅為17.7%和15.2%，說明舒巴坦和他唑巴坦均能有效抑制β內酰胺酶。由于鮑曼不動桿菌對β內酰胺類抗生素的耐藥主要是產生β- 內酰胺酶，而且不動桿菌極易經質粒結合,并與多種耐藥質粒共存。可以是質粒介導的TEM - 1 和TEM - 2β-內酰胺酶,也可以由染色體介導的β- 內酰胺酶，或由于青霉素結合蛋白（PBPs） 的改變等原因導致耐藥。所以本組鮑曼不動桿菌對氨芐西林加舒巴坦后的耐藥率由100%降至48.3%，對哌拉西林加他唑巴坦后的耐藥率由54.4%降至17.7%。因此在對鮑曼不動桿菌感染的治療時,可選用加舒巴坦或他唑巴坦的β內酰胺類抗生素。不加酶抑制劑的抗生素已不適合臨床應用，不能作為經驗用藥。

    3.4  鮑曼不動桿菌產生耐藥的機制比較復雜,且多重耐藥率很高，還能誘導革蘭陰性桿菌產ESBLs 與高產AmpC 酶的作用［4］。 在本組42株多重耐藥的鮑曼不動桿菌中,均檢測有TEM-1和ampC基因,5株（12%）檢測到ESBLs, 說明鮑曼不動桿菌對β內酰胺類抗生素有極高的耐藥性。尤其AmpC酶的普遍存和過量表達，表現出對β- 內酰胺酶極高的水解活性,可水解第三代頭孢菌素。由于AmpC酶為非誘導酶,無論誘導劑是否存在,均可高產此水解酶。所以在抗感染治療中，要嚴格禁止隨意使用第三代頭孢菌素，以防止或延緩各種高耐藥株細菌的產生與蔓延。

    3.5  本組多重耐藥的鮑曼不動桿菌均產生氨基苷乙酰轉移酶［aac（3）-1 和aac（3）-2］,而普通株均不產該酶,說明aac（3）基因與鮑曼不動桿菌的多重耐藥有密切關系。另外,由gyrA和gyrB分別編碼的2 A或B亞單位是喹諾酮類藥物靶位的DNA旋轉酶,其主要功能是催化革蘭陰性菌的DNA超級結構。是否耐藥取決于DNA旋轉酶的1個或2個基因點的突變, 本組多重耐藥株在83位點上的絲氨酸（TCA）被亮氨酸（TTA）取代是喹諾酮類藥物的耐藥原因。

    3.6  本研究說明,鮑曼不動桿菌的多重耐藥與同時產TEM型廣譜酶,高產AmpC酶, aac（3）基因編碼的氨基苷乙酰轉移酶和gyrA基因編碼的DNA旋轉酶突變有密切關系。

     作者：許景峰，徐 琳，樊衛紅《中華醫藥雜志》

【參考文獻】

  1 National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performanre standards for antimicrobial susceptibility testing. 9th informational supplemented.W zyne,PA :National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1999, 32-36.

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3 張征 ,孫靜娜,楊繼章. 鮑曼不動桿菌產去阻遏持續高產AmpC 酶檢測及耐藥性分析. 中國藥房,2006,17 （14 ）:1091-1092.

4 Bou G,O liver A,M artinez-Beltran J. OXA-24, a novel classD beta-lactamase wit??h carbapenemase activity in an Acinetobacter baumannii clinical strain. Antimicrob Agents Chemother, 2000, 44（6） :1556-1561.

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