1.桿狀病毒基因組的結構和功能研究

桿狀病毒基因組為雙鏈環狀 DNA分子。DNA以超螺旋方式被壓縮包裝在桿狀核衣殼(rod.shaped nueleocapsid)內，核衣殼包被脂質蛋白囊膜(envelope)后形成病毒粒子。核衣殼包括衣殼(capsid)蛋白和髓核(COle)。其中衣殼蛋白是桿狀病毒粒子的主要結構蛋白；髓核由病毒DNA分子和與其密切相關的堿性蛋白構成。堿性蛋白同DNA緊密結合以維持其復雜有序的超螺旋結構。

目前已知基因組全序列的桿狀病毒有苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)b]、家蠶核多角體病毒(BmNPV) 、黃杉毒蛾多核衣殼核多角體病毒(OpMNPV)、舞毒蛾多核衣殼核多角體病毒(LdMNPV) 、甜菜夜蛾多核衣殼核多角體病毒(SeMNPV)、棉鈴蟲核型多角體病毒(HaNPV)，以及斜紋夜蛾核型多角體病毒(SphMNPV)。

目前AcMNPV基因組的研究最為深入，它是雙鏈超螺旋大分子環狀DNA，其大小為90～160kb，約編碼154個基因。AcMNPV基因組的基因組織(gene organization)較為復雜，基因組的不同區域具有功能分化，基因的分布尚無規律可循，但AcMNPV基因組含有8個同源區，每區含有不等的重復或倒置重復序列，這些重復序列由位于中間的不完整回文序列及其兩側各約20bp的序列構成。同源區是桿狀病毒基因組普通存在的功能域結構，對于基因表達的調節具有增強作用，同時也是 DNA復制的原點。

桿狀病毒中現已鑒定的基因近70種，可分為結構蛋白基因和非結構蛋白基因兩大類。結構蛋白基因如 polh、P10、gp64、p6.9、gp41、vp39等基因。非結構基因中，與DNA復制相關的重要基因有helicase基因(he1)、dnapol、lef-1、lef-2、lef-3、ie-1、/ie-2、p35、pe-38等；起表達調節作用的基因主要有 ie-1、ie-2、lef類基因、p35、pe38等。這些代表性基因與其功能的關系見表1。

 

2．桿狀病毒載體表達系統的特點

AcNPV病毒用作外源基因的表達載體，通常是通過體內同源重組的方法，用外源基因替代多角體蛋白基因而構建重組病毒。由于多角體基因啟動子在感染后18~24h開始轉錄和翻譯，一直持續到70 h。外源基因置換掉多角體基因后，并不影響后代病毒的感染與復制，意味著重組病毒不需要輔助病毒的功能。

桿狀病毒表達系統自從第一次用來表達干擾素以后在許多重組蛋白的表達中得到廣泛應用，例如用于表達白介素(IL)一2，3、BMP及多種病毒蛋白等。相對其他表達系統它具有以下幾個方面的特點：

①重組蛋白具有完整的生物學功能：桿狀病毒表達系統可為高表達 的外源蛋白在細胞內進行正確折疊、二硫鍵的搭配及寡聚物的形成提供良好的環境，可使表達產物在結構及功能上接近天然蛋白。

②能進行翻譯后的加工修飾：桿狀病毒表達系統具有對蛋白質完整的翻譯后加工能力，包括糖基化、磷酸化、酰基化、信號肽切除及肽段的切割和分解等，修飾的位點與天然蛋白在細胞內的情況完全一致：對比實驗證明，在昆蟲細胞發生的糖基化位點與哺乳動物細胞中完全一致，但修飾的寡糖種類卻不完全一樣。這種不一致對不同目的蛋白的活性影響不同，所以昆蟲表達系統還可作為一個研究糖基化對蛋白質結構與功能影響方面的理想模型。

③表達水平高：與其它真核表達系統相比較，此系統最突出的特點就是能獲得重組蛋白高水平的表達，最高可使目的蛋白的量達到細胞總蛋白的50％。

④能容納大分子的插入片段：桿狀病毒毒粒可以擴大，并能包裝大的基因片段，但目前尚不知桿狀病毒所能容納的外源基因長度的上限。

⑤能同時表達多個基因：桿狀病毒表達系統具有在同一細胞內同時表達多個基因的能力。既可采用不同的重組病毒同時感染細胞的形式，也可在同一轉移載體上同時克隆兩個外源基因，表達產物可加工形成具有活性的異源二聚體或多聚體。另外，昆蟲桿狀病毒表達系統具有剪切的功能，能表達基因組DNA；還有對重組蛋白進行定位的功能，如將核蛋白轉送到細胞核上，膜蛋白則定位在膜上，分泌蛋白則可分泌到細胞外等。最后，桿狀病毒對脊椎動物無感染性，現有研究也表明其啟動子在N-％動物細胞中沒有活性，因此在表達癌基因或有潛在毒性的蛋白時可能優于其它系統。

3．桿狀病毒載體的重組與篩選

桿狀病毒由于基因組龐大，外源基因的克隆不能通過酶切連接的方式直接插入，必須通過轉移載體的介導．即將極晚期基因(如多角體基因及其邊界區)克隆入細菌的質粒中，消除其編碼區和不合適的酶切位點，保留其5’端對高效表達必需的調控區，并在其下游引入合適的酶切位點供外源基因的插入，即得到轉移載體。將要表達的外源基因插入其啟動子下游，再與野生型AcNPV DNA共轉染昆蟲細胞，通過兩側同源邊界區在體內發生同源重組，使多角體蛋白基因被外源基因取代。而將外源基因整合到病毒基因組的相應位置，由于多角體基因被破壞，則不能形成多角體。這種表型在進行常規空斑測定時，可同野生型具有多角體的病毒空斑區別開來，這就是最初的篩選重組病毒的方式。但由于重組效率較低(0.1％-1％)，表型差別不顯著，應用上有一定的困難。為此，經過不斷探索，在重組桿狀病毒的篩選與鑒定方面取得了很大改進，具體方法有以下幾種。

3.1．半乳糖苷酶的藍白篩選

1990年，Vialard等在多角體基因的上游，利用pl0基因啟動子帶動LacZ基因構建了轉移載體pJVNheI。將其共轉染sf細胞后，重組病毒可表達B-半乳糖苷酶，通過加入x-gal使之形成藍色空斑，便可進行重組病毒的篩選。1990年，Kins提出了線形化技術，其原理是線形化的桿狀病毒基因組感染性很低，但仍具有與引入細胞內的同源序列進行同源重組的能力。如果同源序列位于線形化桿狀病毒的兩端，則基因組即可環化恢復完整的感染性，使陽性重組率大大提高。

3.2．體外酶促定位重組

Cre-Loxp系統最早由Sternberg等最早建立，噬菌體Pl含有1個重組位點Lox(1ocus of(rossover)和1個Cre酶基因，其產物(Cre酶)為重組所必需：Cre酶已被克隆純化；Lox序列已被測定由34個核苷酸組成，其兩端為13 bp的反轉重復序列。中間為8 bp的非回文序列。將此序列引入AcNPV基因組即得vAclox，轉移載體引入lox后可獲得plox。vAclox和 plox在Cre酶存在條件下，兩者即可發生體外定點重組，而將載體上的相應序列轉到病毒的基因組中(這是1個可逆酶促反應)，將反應混合物轉染草地夜蛾(spodoptera frugiperda)sf細胞中，即可得到高比例的重組子代病毒。這個方法的特點是體外重組，通過控制反應的條件可達到很高的重組率。但由于重組是位點特異性的，反應產物往往是轉移載體多次插入親代病毒的結果，因而要進行多輪空斑實驗純化病毒。

3.3．Bacmid

后來Luckow等又發明了一種新的桿狀病毒重組技術。他們根據 F因子載體原理，用類似于酵母體內重組的方法，構建了一種新桿狀病毒穿梭載體Bacmid。該載體可像質粒一樣在大腸桿菌中生長，又對鱗翅目昆蟲細胞具有感染性。Bacmid含有F因子復制子(可在大腸桿菌中復制)、卡那霉素抗性基因及Tn7轉座位點attTn7。轉移載體中，外源基因置于桿狀病毒啟動子之下，兩端分別為Tn7的左右端。以其轉化含Bacmid的E coli菌株，由輔助質粒提供反式作用發生轉座，而將外源基 因轉到 Bacmid的attTn7位置。這種重組了外源基因的 Bacmid轉染的昆蟲細胞 ，可得到 100％陽性重組病毒。這種方法都是在大腸桿菌中進行的，非常簡便，由于沒有本底干擾 ，同樣不需進行空斑純化。缺點是 F因子提取不很方便，其穩定性也有待于觀察 。

3.4．TK基因

胸苷激酶可將核苷類似物轉變成的有毒的中間體而抑制病毒的復制。該核苷類似物作為皰疹病毒編碼胸苷激酶(HSV—TK)的底物，能特異性地抑制單純皰疹病毒、巨細胞病毒和EB病毒的復制。由于這些類似物對病毒的胸苷激酶有高度的選擇性，而細胞 自身胸苷激酶對這些類似物的結合常數很低 ，故能選擇性地殺死表達 HSV-TK基因的細胞。

3.5．Neo基因

Neo是經典的顯性選擇標記，這是一種細菌編碼的磷酸轉移酶基因，可使氨基糖苷類抗生素 G418失活。后者又是一種蛋白質合成抑制劑，可干擾真核細胞80S功能。Neo曾被引入幾種脊椎動物病毒(如痘苗病毒和EB病毒)的基因組中，作為選擇標記。1989年，Jarls將Neo引入sf細胞染色體中而得到 G418抗性的細胞系，說明Neo可作為選擇標記用于重組病毒的篩選。本方法和TK基因相比較略顯繁瑣，需經連續傳代，但其不用改造輔助病毒，只需在轉移載體中引入Neo基因即可。其它如 PCR、DNA斑點雜交及有限稀釋法等，也可用于篩選重組病毒。以上方法各具特點。雖然有些新方法需一定的條件，但一旦建立起來后就可方便、迅速地得到重組病毒，為桿狀病毒表達系統的普及應用創造了良好的條件

4 ．影響外源蛋白表達的因素

利用桿狀病毒昆蟲表達系統表達外源基因的理論基礎，就是桿狀病毒的基因表達與調控，但有關病毒晚期基因高表達和其調控機制目前還不十分清楚。利用多角體基因的啟動子表達外源基因，影響表達水平的因素除與病毒本身的因素有關外，還與受感染細胞的種類和生理狀況乃至培養基的質量有關。

4.1．病毒的穩定性

桿狀病毒在細胞中多次傳代后，可能引起基因組的變化。最明顯的變化就是形成ov的能力 降低。由于細胞間不需要ov形成感染，只需通過BV病毒感染即可。多次傳代的病毒也可能出現少多角體(few polyhedfin，FP)表型的變化，一般每個感染細胞只含有10個多角體病毒。其中突變病毒多角體的表達水平也有所降低，應用這種突變病毒會對外源基因的表達帶來不利。若重組前病毒是變異FP，通過肉眼分辨重組與非重組病毒時，有可能發生假象。另外，長期多次傳代的病毒也往往引起表達水平的降低，為避免上述情況的發生，要限制病毒的傳代次數，一般控制在2-3代以內。

4.2．在昆蟲細胞內表達與幼蟲體內表達

雖然目前大部分工作是在細胞培養條件下進行的，當需要大量制備某類表達產物時，最好采用昆蟲蛹。因為培養昆蟲幼蟲遠比培養細胞簡單、便宜，而且在昆蟲體內培養可以提高表達量。一般在幼蟲體內的淋巴液中，蛋白含量較在細胞培養基中高l0倍以上，例如小鼠IL-3的表達量在淋巴液中較在細胞培養上清中高500倍，可能是細胞培養基中含有的蛋白酶使之降解所致。

4.3．啟動子類型

在構建轉移載體時，使用不同的啟動子就需構建相應的同源序列。目前最常用的啟動子有晚期Polh(polyhedrin)啟動子和P10啟動子，還有堿性啟動子以及少數早期啟動子。同一目的基因在不同啟動子控制下，表達水平會有很大差異。研究發現，分泌類蛋白使用PIO啟動子或堿性啟動子的效果更好。

4.4．外源基因序列的本身因素

能在重組桿狀病毒有效表達的外源基因5’端及3’端非編碼區越短越好，一般長度在3～400個核苷酸以內。影響表達的其他因素包括：密碼子的使用情況(是否為昆蟲細胞所常用)、mRNA的穩定性及蛋白質的穩定性等。外源基因附近的序列很重要。Kozak分析了數百個真核序列，得出兩點結論：首先，啟動子下游第1個ATG常作為起始密碼子；其次是在 ATG附近的序列并不是隨機的。有95％表達的真核基因在ATG前-3位是嘌呤(而且常是A)，+4位是G。如果-3的A或+4的G有1個被嘧啶替代，翻譯水平就下降5~l0倍。如果-3位和+4位均被嘧啶所替代，翻譯水平就下降20倍。因此，Kozak提出，(GCC)GGC A／GCC AUG G是高等真核基因起始密碼附近的保守序列，其中-3處A最為保守。

4.5．重組病毒基因的表達與調控

多角體啟動子控制的外源基因的表達，緊靠上游的序列對基因的轉錄調節是最重要的。許多研究表明，當外源基因5 端加有1～58個多角體蛋白的氨基酸序列以融合蛋白形式表達時，效果最好。用高、中與低3種表達的外源基因進行實驗的結果表明，保留一部分多角體5’端序列與外源基因以相同的框架相融合，表達水平最高；如果框架不同，那么從距啟動子最近的起始碼開始翻譯，表達產物水平相對偏低。