【摘要】  目的 了解臨床分離的大腸埃希菌耐藥性和復方磺胺甲口惡唑(SMZ/TMP)耐藥相關基因存在狀況。方法 測定臨床連續分離的60株大腸埃希菌對19種抗菌藥物的敏感性，采用聚合酶鏈反應(PCR)檢測SMZ/TMP耐藥相關基因(sul1、dfrA1、dfrA17)。結果 60株中sul1、dfrA1、dfrA17基因陽性分別為34株(56.7%)、1株(1.7%)、35株(58.3%)。結論 臨床分離的大腸埃希菌多重耐藥嚴重；復方磺胺甲口惡唑耐藥相關基因攜帶率高。

【關鍵詞】  大腸埃希菌； 復方磺胺甲口惡唑； 耐藥基因

    ABSTRACT  Objective  To investigate the drug resistance and drug resis??tance�瞨elated trimethoprim�瞫ulfamethoxazole genes in Excheric?hia coli.  Method  Microdilution tests were performed?? to detect suscep?tibility of 60 strains of Escherichia coli to 19 antimicrobial agents and drug r?esistance�瞨elated trimethoprim�瞫ulfamethoxazole were detected by PCR. ? Result  The positive rates of sul1, dfrA1 and dfrA17 genes in 60 clinical strains of Escherichia coli were 56.7%, 1.7%, 58.3%, respectively.  Conclusions  There a?re multiple�瞕rug resistance and high positive rate of drug resistance�瞨elated trimethoprim�瞫ulfamethoxazde genes in Escherichia coli isolated f?rom the hospital.

    KEY WORDS&?nbsp??; Escherichia coli;  Trimethoprim�瞫ulfamethoxazole;  Resistant genes

      多年來，大腸埃希菌(Escherichia coli，EC)一直是醫院感染的重要病原菌之一。EC菌對β��內酰胺類和氨基糖苷類在內的常用抗菌藥物出現多重耐藥性，相關耐藥基因研究已有報道。經檢索國內尚無EC菌的復方磺胺甲口惡唑(SMZ/TMP)耐藥相關基因報道。龙8娱乐官方网站對60株連續分離株EC菌進行了藥敏表型檢測，并進行了SMZ/TMP耐藥相關基因sul1、dfrA1、dfrA17檢測，現報道如下。

    1  材料與方法

    1.1  菌株來源    60株EC菌均分離自2006年08月～2006年12月間麗水市人民醫院住院患者臨床標本，其中痰液10例，尿液24例，血液2例，分泌物24例(膿液15例、腹水4例、引流液3例、咽拭子2例)。全部菌株用Bio�睲erieux ATB細菌鑒定儀鑒定菌種。標準菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。

    1.2  抗菌藥物敏感性試驗

    用微量肉湯稀釋法測定19種抗菌藥物的敏感性，并根據美國CLSI 2006年版要求進行敏感性判斷。

    1.3  細菌處理    挑純培養菌落置入0.5ml離心管內(內預置200ng/ml蛋白酶K溶液200μl)，56℃水浴2h，然后95℃水浴10min，加入Chelex 100樹酯40μl，離心(15000r/min)30s。上清液即為基因檢測的模板液，-20℃冰箱保存備用。

    1.4  基因檢測

    用聚合酶鏈反應法(PCR)進行檢測。PCR引物序列見表1。PCR擴增體系為：每反應體系P1、P2引物各0.5μmol，dNTPs各200mmol，KCl 10mmol，(NH4)2SO4 8mmol，MgCl2 2mmol，Tris�睭Cl(pH9.0) 10mmol，NP40 0.5%，BSA 0.02%(wt/vol)，Taq DNA pol 1U；總反應體積20μl(其中模板液5μl)。熱循環參數為：93℃預變性2min，然后93℃30s→55℃30s→72℃60s，循環35周期，再72℃延伸5min。耐藥基因檢測試劑盒、靶基因PCR引物序列和陽性對照DNA由無錫市克隆遺傳技術研究所提供(表1)。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠電泳成像儀下觀察，并紀錄結果。表1 sul1、dfrA1、dfrA17基因PCR引物序列及產物長度

    2  結果

    2.1  藥敏試驗結果

    60株EC菌連續分離株對亞胺培南和美羅培南敏感。對頭孢他啶、阿莫西林/克拉維酸、頭孢西丁、阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/三唑巴坦等6種抗菌藥物的敏感率在53.3%～95%；對頭孢噻肟、頭孢呋辛、妥布霉素、慶大霉素、環丙沙星、哌拉西林、阿莫西林和替卡西林等8種抗菌藥物的耐藥率在50%～90%。對復方磺胺甲口惡唑的耐藥率為66.7%。

    2.2  sul1、dfrA1、dfrA17基因

    sul1、dfrA1、dfrA17基因陽性率分別為56.7%(34/60)、1.7%(1/60)、58.3%(35/60)。有35株檢出dfrA基因(58.3%)，40株檢出sul和(或)dfrA基因(66.7%)。圖1為sul1基因PCR產物電泳圖。dfrA17基因PCR產物經測序與美國GenBank核酸數據庫中已登錄的dfrA17基因序列完全一致。

3  討論

    EC菌廣泛分布于自然界、健康人的皮膚、腸道和呼吸道。正常情況下，EC菌并不感染人體的任何組織，但當人體免疫力降低、長期大量使用廣譜抗菌藥物或創傷性醫療操作等情況下易引起內源性感染。EC菌所致感染中以泌尿道感染、呼吸道感染、菌血癥等最常見。

    復方磺胺甲口惡唑為磺胺甲基異口惡唑(sulfame�瞭hoxazole，SMZ)與甲氧芐胺嘧啶(trimethoprim，TMP)的復合制劑，磺胺的抑菌機制為與化學結構相似的對氨苯甲酸(PABA)競爭二氫葉酸合成酶(DHPS)，使二氫葉酸合成減少；甲氧芐胺嘧啶能抑制二氫葉酸還原酶(DHFS)，使四氫葉酸的生成受阻。磺胺藥與甲氧芐胺嘧啶合用后，分別作用于細菌葉酸合成的不同環節，因而有協同作用［1］。近年來，對細菌的可移動性遺傳元件研究發現，I類整合子的耐藥基因盒中常攜帶二氫葉酸合成酶的編碼基因sul1，有些同時還攜帶二氫葉酸還原酶的編碼基因dfrA(早期文獻中以dhfr表示)［2～4］。細菌額外獲得sul1基因，所表達的二氫葉酸合成酶抵消了磺胺與PABA競爭性抑制作用，導致細菌耐磺胺。細菌額外獲得dfrA基因，所表達的二氫葉酸還原酶補充了甲氧芐胺嘧啶靶位酶，導致細菌耐甲氧芐胺嘧啶。

    為了解EC菌復方磺胺甲口惡唑耐藥相關基因存在狀況，龙8娱乐官方网站根據美國GenBank核酸數據庫中已發布的腸桿菌I類整合子基因序列，自行設計了sul1、dfrA1、dfrA17基因PCR擴增引物。結果顯示有40株檢出sul和(或)dfrA基因(66.7%)，表型與基因型基本相符。對臨床連續分離EC菌的復方磺胺甲口惡唑(SMZ/TMP)耐藥相關基因的專題研究國內為首次報道。

1996年，在O139群霍亂弧菌中發現一種整合性接合元件，該元件整合于細菌染色體上(長約100kbp)編碼對磺胺甲基異口惡唑與甲氧芐胺嘧啶的抗性，被稱為SXT元件［5］。SXT元件不僅存在于霍亂弧菌中，其它細菌內也有發現［6］。EC菌是否存在SXT元件需要進一步研究。

作者：王偉 糜祖煌 毛劍鋒 徐偉珍  《中國抗生素雜志》 

【參考文獻】

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［6］ B??urrus V, Marrero J?, Waldor M K. The current ICE age: Biology and evolution of SXT�瞨elated integrating conjugative elements ［J］. Plasmid,2006,55(3):173～183.

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