【摘要】  目的 監測大腸埃希菌臨床分離株的耐藥性，了解大腸埃希菌中Ⅰ類整合子的流行情況和分子特性。方法 臨床分離114株大腸埃希菌經全自動細菌分析系統鑒定并檢測耐藥性，應用PCR法擴增質粒DNA上Ⅰ類整合子，對PCR產物進行酶切分析和DNA測序。將序列結果在GenBank中搜索，確定Ⅰ類整合子可變區基因盒的種類和排列。結果 細菌耐藥率>50%，且大多為多重耐藥菌(耐受3種以上抗生素)。在58株細菌的質粒DNA上檢測到Ⅰ類整合子序列，大小約600~3 500 bp，各含1~3個Ⅰ類整合子。整合子中最常見的基因盒為dfrl7(甲氧芐啶耐藥基因)與aadA5(鏈霉素、壯觀霉素耐藥基因)，最主要的基因盒排列為dfrl7-aadA5。絕大多數攜帶甲氧芐啶耐藥基因盒的菌株對復方新諾明耐受，大多數攜帶鏈霉素、壯觀霉素耐藥基因盒的菌株對鏈霉素不敏感。結論 目前臨床分離的大腸埃希菌耐藥性強，并廣泛存在Ⅰ類整合子。菌株攜帶基因盒和耐藥表型之間有較好的對應關系，基因盒介導了細菌耐藥性。細菌的多重耐藥率與Ⅰ類整合子的陽性率相關。

【關鍵詞】  大腸桿菌O157;藥物耐受性; 整合子類;基因, 細菌; 抗菌藥

大腸埃希菌是引起人類感染最常見的腸桿菌科細菌[1]，其耐藥形勢十分嚴峻。細菌耐藥性通常由獲得耐藥基因引起，耐藥基因的水平傳播使耐藥菌株廣泛流行[2]。整合子是耐藥基因水平轉移的主要因子，是含有位點特異重組系統和基因盒的遺傳結構，也是一個基因盒整合和切除系統，包括對基因盒的捕獲、切除和表達[3]。整合子根據整合酶的不同而分類，其中Ⅰ類整合子最常見，本研究分析大腸埃希菌中Ⅰ類整合子的流行情況和分子特性。

　　1 材料與方法

　　1.1 菌株 于2005年10月-12月自福建省立醫院各科室臨床標本中分離大腸埃希菌114株，細菌經全自動細菌分析系統(Vitek 2，美國BioMerieux)檢測并進行22種抗生素敏感性測定。對四環素、氯霉素、鏈霉素、萘啶酸的耐藥性用紙片法測定。

　　1.2 方法

　　1.2.1 PCR試劑及反應條件 用堿裂解法制備PCR模板質粒DNA，Ⅰ類整合子的引物序列：

　　上游：5'-GGC ATC CAA GCA GCA AG-3'

　　下游：5'-AAG CAG ACT TGA CCT GA-3'

　　PCR反應體系：模板1 μL，上下游引物(l0 μmol/L)各1 μL，dNTP(200 μmol/L)2 μL，10×buffer，MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.125 μL，超純水17.375。反應條件：預變性94 ℃ 6 min→變性94 ℃ 30 s→退火60 ℃ 1 min→72 ℃ 2 min，35個循環;延伸72 ℃ 10 min。對擴增產物進行瓊脂糖電泳檢測。

　　1.2.2 限制性內切酶反應 HinfI(10 U/μL,TakaRa)，酶切反應體系：PCR產物6 μL，10×酶切緩沖液1 μL，Hinfl(10 U/μL)0.5 μL，超純水2.5 μL。37 ℃反應14 h，加入1 μL 10×酶切緩沖液終止反應，對酶切產物進行瓊脂糖電泳檢測。

　　1.2.3 PCR產物測序 PCR產物的純化及測序由大連寶生物工程有限公司完成。

　　1.3 統計學處理 數據以SPSS 11.5統計軟件處理，采用χ2檢驗，細菌多重耐藥率和整合子陽性率進行顯著性檢驗，P<0.05為差別有統計學意義。

2 結 果

　　2.1 大腸埃希菌的鑒定和藥敏 114株大腸埃希菌經BioMerieux全自動細菌分析儀鑒定，對26種抗生素的敏感性試驗結果分析，細菌對其中12種抗生素的耐藥率>50%，耐藥率高的抗生素包括氨芐青霉素(100%)、復方新諾明(80%)、氨芐西林/舒巴坦(80%)、左旋氧氟沙星(64.8%)慶大霉素(60%)等;中介率最高的為妥布霉素(40%);敏感率最高的是亞胺硫霉素(亞胺培南，100%)。

　　2.2 Ⅰ類整合子的檢測結果 對114株大腸埃希菌進行Ⅰ類整合子的擴增，陽性58株，PCR產物的大小分別為600，1 000，1 600，2 000，2 500，3 500 bp各株細菌含1～3個Ⅰ類整合子。根據各株細菌質粒DNA上檢測到Ⅰ類整合子的大小和數目，細菌質粒DNA上的整合子可分為10種整合子譜(表1，圖1)。表1 Ⅰ類整合子譜

　　1-9:不同類型的Ⅰ類整合子;10:200 bp DNA ladder

　　2.3 Ⅰ類整合子中基因盒分析 選擇600，1 000，1 600，2 000 bp的Ⅰ類整合子送公司進行純化及測序。將測序結果在GenBank中用Blastn進行核酸序列搜索，各整合子中所含基因盒種類和排列見表2。600，1 000，1 600 bp整合子序列與GenBank中序列號為AY748452.1、AB154408.1、DQ663488的核酸序列相同。表2 各整合子所含的基因盒種類和排列

　　攜帶基因盒dfr17的47株細菌中，40株對復方新諾明耐藥，攜帶基因盒aadA2或aadA5的47株細菌中，39株對鏈霉素耐藥，攜帶基因盒acc(6')的2株細菌對慶大霉素、妥布霉素均耐藥，說明細菌的耐藥表型與其攜帶的基因盒有很好的對應關系。有4株攜帶dfr17-aadA5基因盒的菌株對鏈霉素敏感，這種現象可能是由于耐藥基因的低水平表達或沉默引起的[4]。

　　2.4 酶切結果 對于電泳檢測為大小相同的Ⅰ類整合子，選用內切酶HinfI對Ⅰ類整合子進行酶切，并對酶切產物進行電泳檢測分析。結果發現，3個600 bp，3個1 000 bp，44個1 600 bp，2個2 000 bp的整合子分別是相同的DNA序列(圖2)。

　　2.5 Ⅰ類整合子與多重耐藥的關系 Ⅰ類整合子陽性的菌株比陰性的菌株更易表觀出對氨基糖苷類、喹諾酮類及第三代頭孢菌素藥物的耐藥性，也更易介導多重耐藥性，Ⅰ類整合子陽性的菌株與大腸埃希氏菌多重耐藥(耐受3種以上抗生素)作統計學分析(χ2檢驗，χ2=9.48)，二者差別有統計學意義(P<0.05，表3)，說明細菌多重耐藥與整合子有關。表3 Ⅰ類整合子與多重耐藥的關系

　　3 討 論

　　本組中114株大腸埃希菌中有58株(50.9%)攜帶I類整合子，整合子中最常見的基因盒為鏈霉素、壯觀霉素耐藥基因盒(aadA)，以及甲氧芐啶耐藥基因盒(dfr17)。原因是： 鏈霉素、壯觀霉素在食源性動物飼養中還廣泛使用，所以人類可以通過食物鏈或接觸動物獲得相應基因盒的整合子[5]。 甲氧芐啶在泌尿道感染的治療中，作為一線藥物使用，造成甲氧芐啶的選擇性壓力很大[6]。 aadA和dfr兩個基因家族與整合子關系最密切，是整合子介導的最常見的抗藥基因型[7]。實驗觀察到細菌攜帶基因盒與其耐藥表型有很好的對應關系，這充分說明了基因盒中的耐藥基因介導了細菌相應的耐藥性，整合子在介導細菌耐藥性方面發揮著重要作用，因此監測臨床分離株整合子的耐藥基因盒對指導臨床用藥有一定作用。

　　Ⅰ類整合子陽性菌的耐藥率高于陰性菌株,整合子陽性的菌株對抗生素的多重耐藥率也顯著高于整合子陰性的菌株，整合子陽性的菌株更易表現出對青霉素類、磺胺類、喹諾酮類的多重耐藥。說明多重耐藥菌在院內的暴發流行與其攜帶的整合子有關。

整合子具有通過位點特異重組機制整合多個耐藥基因盒的能力[8]。醫院環境下的臨床菌株在更大的抗生素選擇性壓力下，耐藥基因盒更容易被整合子捕獲和積聚。目前，幾乎每一類抗生素的耐藥基因盒都被發現，但世界各地均發現耐藥基因盒主要與傳統抗生素相關，如鏈霉素、甲氧芐啶、早期的氨基糖苷類藥物。然而，新抗生素的耐藥基因盒己經出現，如blaIMP(編碼對亞胺培南、廣譜β-內酸胺類抗生素的耐藥性)、aacA7(編碼對新氨基糖昔類藥物如阿米卡星、奈替米星的耐藥性)，這些基因盒還沒有獲得足夠的選擇壓力或時間廣泛傳播，而整合子具有強大的捕獲和積聚基因盒的能力，可能不久將使這些新抗生素的耐藥基因盒流行[5]。因此，整合子將繼續影響抗生素的有效性。

作者：陳婉花， 伍嚴安， 胡辛蘭， 吳長生， 李寧《福建醫科大學學報》

【參考文獻】
  　[1] 李 華,馬筱玲. 臨床分離大腸埃希菌耐藥性檢測[J]. 安徽醫學,2007(1):72-73.
　　[2] 楊仁國,呂曉菊. 整合子系統與細菌多重耐藥研究進展[J].中國抗生素雜志，2008，33(4):198-202.
　　[3] 陳紅英,胡功政,李新生,等. 整合子與細菌多重耐藥性[J]. 動物醫學進展，2006，27(4)：29-32.
　　[4] Severino P,Magalhaes V D. The role of integrons in the dissemination of anti- biotic resistance among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa from an intensive care unit in Brazil[J]. Res Microbiol, 2002,153(4):221-226.
　　[5] Ribera A,Vila J,Fernandez-Cuenca F,et al. Type 1 integrons in epidemiologi-cally unrelated Acinetobacter baumannii isolates collected at Spanish hospitals[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2004,48(1):364-365.
　　[6] Maguire A J,Brown D F,Gray J J,et al. Rapid screening technique for class 1 integrons in Enterobacteriaceae and nonfermenting gram-negative bacteria and its use in molecular epidemiology[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2001,45(4):1022-1029.
　　[7] 石 磊,陳 洵,肖增磺. 多重耐藥臨床菌株中整合子結構的監測與分析[J]. 中國抗生素雜志,2007,32(1):43-48.
　　[8] Daly M,Buckley J,Power,E,et al. Molecular characterization of Irish Salmonella enterica serotype typhimurium:detection of class I integrons and assessment of gene-tic relationships by DNA amplification fingerprinting[J]. Appl Environ Microbiol, 2000,66(2):614-619.

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