幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)是引起萎縮性胃炎和胃潰瘍等慢性炎癥的致病因子,流行病學和動物實驗證實,Hp慢性感染是導致胃癌的重要危險因素,1994年世界衛生組織已將其列為I類致癌原[1]。Hp感染機體后在臨床上所表現出的不同結局除與宿主和環境因素有關外,還與Hp菌株的異質性,即基因組的高度多態性有關,尤其是毒力基因的異質性,決定Hp感染后是否導致炎癥、潰瘍乃至胃癌的發生。Hp確切的致癌機制尚不清楚,大量研究表明:cagA與vacA基因分別是發生胃癌的高危險因子[2]。隨后陸續發現iceA、oipA、babA 等基因與胃癌的發生密切相關,但這些基因無一單獨可作為疾病特異性的標志。隨著比較基因組學和功能基因組研究的開展,人們開始將尋找Hp致病特異基因(尤其是與致癌相關的基因)的目標投向其“可塑區”(plasticity region)。筆者現就與胃癌相關的Hp毒力基因在胃癌形成過程中的作用的研究進展綜述如下。
1 cagA(cytotoxin associated gene )基因與cag致病島
cagA是編碼高分子量免疫活性抗原的基因,5′端相對保守,3′端相對多變,是評價Hp毒力指標之一。根據cagA的有無通常將HP分成兩型:Ⅰ型菌含cagA基因,表達CagA蛋白,具有空泡毒素活性,與臨床疾病關系密切;Ⅱ型菌不含cagA基因,不表達CagA蛋白,無空泡毒素活性。1996年,國外學者在研究Ⅰ型(VacA +,CagA+)和Ⅱ型(VacA,CagA)Hp菌株的遺傳學差異與致病關系時發現,Ⅰ型Hp菌株含有一個大約40 kb的特殊DNA片段,具有細菌致病島的典型特征,因此將其稱為cag致病島(pathogenic island,PAI)。cagA是PAI的一個標志性基因。Held等進行病例對照研究發現,cagA+Hp的患者患胃腺癌的危險是cagA-Hp的7.4倍(95% CI 3.3~16.6)[3]。有研究人員經過對179 例患者的平均14.2年的隨訪發現,cagA+的 Hp菌株感染者發展成胃癌是無Hp感染者的5.8倍。另有研究發現,cagA+的Hp菌株感染能明顯加重胃黏膜的損傷,使其失去正常的上皮細胞結構,感染有cagA基因的Hp菌株明顯增加胃癌的危險性。總之cagA和cag致病島陽性Hp菌株的毒性大,與十二指腸潰瘍和胃癌等疾病密切相關。
近年來,對cagA基因的研究轉向基因亞型即等位基因方面,揭示了cagA基因多態性與宿主臨床結局的部分相關性。cagA基因
通過IV型分泌系統進入胃上皮細胞的CagA蛋白,被非受體型酪氨酸激酶家族的csrc激酶和Lyn激酶磷酸化,磷酸化的CagA蛋白與Scr同源區2(SRC homology 2 domain,SH2)結合后,激活后者的磷酸化酶活性,而引起瀑布式的級聯反應,強烈干擾細胞的信息傳導通路所致。例如通過激活絲裂原激活的蛋白激酶,胞外調節蛋白激酶,從而導致細胞離散及浸潤性生長引起嚴重的胃黏膜損傷,使胃黏膜退化和增殖加劇,增加了未修復基因及基因突變的可能性,CagA促進了癌前病變的發生和發展[7]。Higashi研究發現磷酸化的CagA與含SH2酪氨酸磷酸酶SHP2形成復合物,并激活磷酸酶,破壞復合物會取消依賴的細胞反應。CagASHP2復合物相互作用可能在發病機制中起重要作用,導致胃癌的發生[8]。有研究則認為CagA與胃癌前疾病及胃癌的發生有著網絡樣的關系,通過對癌基因、抑癌基因及DNA損傷等作用影響胃黏膜細胞的增生與凋亡的平衡[9]。CagA+Hp感染使胃癌前疾病患者黏膜中的bax、bcl2、p16、p21表達均增高。CagA為影響四種蛋白表達的主要因子,CagA可能通過促進這些蛋白的表達,影響胃黏膜細胞的增生和凋亡,增加了DNA損傷復制錯誤及基因突變的可能性;DNA的損傷引起p53等的高表達,p53可能突變,抑制了bax、p16、p21的表達,使腫瘤細胞逃避了凋亡機制,引起了胃癌的發生。CagA也可通過下調bcl2的表達、促進bax的表達誘導胃黏膜上皮細胞凋亡。
2 vacA(vacuolating cytotoxin)基因
vacA基因存在于所有的菌株中,但僅在50%~60%的菌株表達。表達的前體蛋白質為136~140 kD,在VacA分泌過程中,VacA的信號肽協助前體蛋白穿過細菌內膜后留在內膜,VacA的C末端插入外膜協助前體蛋白通過后而留在外膜,分泌形成成熟的蛋白質分子量為87 kD或者95 kD。成熟的蛋白質可以被柔軟的環區(LOOP)分為37 kD亞單位與58 kD亞單位。VacA是一種AB型毒素,降解產生兩個分子量分別為37 kD和58 kD的亞單位,37 kD亞單位為VacA的A亞單位,表達生物的毒性,58 kD亞單位則為B亞單位,主要是與靶細胞結合之亞單位。
Atherton等發現Hp的vacA為一種嵌合體,任意信號序列s
VacA可能是通過作用于細胞膜上的Na+K+ATP酶,影響離子間轉運而引起細胞的空泡樣變性。同時VacA不僅影響細胞增殖,還影響胃黏膜細胞中生長因子的調節機制,促進細胞生長因子及受體的過度表達,引起胃黏膜的增生和癌變。Galmiche等發現:VacA直接損傷線粒體,導致細胞凋亡,并有可能在腫瘤發生早期階段起作用[12]。Yuan等研究表明,VacA能引起線粒體去極化,從而引起胃上皮細胞凋亡,影響或干擾細胞骨架各成分,引起肌動蛋白重排,致使微管結構發生紊亂[13]。幽門螺桿菌vacA基因表達譜的檢測,揭示vacA+通過影響細胞骨架相關蛋白基因的表達以及直接誘導腫瘤相關啟動子基因的表達和抑制腫瘤抑制基因的表達來干擾細胞骨架的結構,從而導致腫瘤產生。同時也改變炎癥和應激反應基因的表達,提示vacA是幽門螺桿菌致胃癌的重要基因[14]。vacA能抑制正常胃黏膜細胞肌動蛋白彈性纖維的形成和打亂微管的結構,顯著減少粘著斑激酶( focal adhesion kinase,FAK)的磷酸化與表達。VacA破壞細胞骨架和干擾細胞信號轉導通路。VacA引起細胞異常增殖可能與表皮生長因子( epidermal growth factor,EGF)有關,EGF等生長因子促進上皮移行和細胞增殖對黏膜的恢復和胃腺體的重建至關重要,EGF可以使EGF受體的表達上調和磷酸化水平提高,并通過第二信使分子IP3(inositol 1,4,5triphosphate)和ras信號通路激活cfos等原癌基因的轉錄。VacA可干擾EGF信號傳遞過程,可抑制胃黏膜損傷的修復;VacA能抑制Hela細胞前溶酶素D的成熟和釋放,抑制EGF滅活,而EGF過度表達可以導致胃癌發生。最近發現VacA可刺激PI3K/Akt信號傳導通路,促進糖原合酶激酶3β的磷酸化(glycogen synthase kinase3beta,GSK3beta),從而抑制GSK3的作用導致βcatenin積累,移位入細胞核從而影響基因的轉錄,從而提出Wnt信號途徑可能在VacA導致胃癌發生機制中發揮重要作用[15]。
3 iceA(induced by contact with epithelium)基因
1998年Peek等根據Hp與胃上皮細胞黏附可能誘導毒力相關基因表達這一假說,通過比較黏附和未黏附于人胃上皮細胞的Hp潰瘍株和胃炎株的mRNA轉錄,發現了一種新的Hp基因iceA。iceA基因分為iceA1和iceA2,是與Hp胃黏膜細胞接觸后誘導表達的基因[16]。iceA1與編碼CATG特異性限制性內切酶的基因nlaⅢ(Neisseria lactamica)有高度同源性,在Hp與胃黏膜上皮細胞接觸后iceA1表達上調。iceA1基因表達意味著上調Hp與上皮細胞的接觸,與潰瘍的發病密切相關,iceA等位基因型是獨立于cagA和vacA的一種毒力因子。Donahue等認為iceAl在大部分Hp菌株中并不是編碼一個功能蛋白,而是在轉錄水平調節其下游基因hpyIM的表達,通過DNA甲基化水平的改變來調控相關毒力基因的表達,從而間接參與Hp的致病作用[17]。
有研究發現iceA1和iceA2在臨床分離株中的陽性表達率分別為68%和80%,大約40%菌株呈雙陽性表型。胃癌病例iceA1+株顯著高于胃炎病例(P<0.01)而且iceA1與vacAs1總是同時表達[18]。也有研究發現iceA1基因在胃腺癌中表達是胃炎的3.6倍,iceA1基因與vacAs1共同存在使發生胃腺癌的幾率增加5.6倍[19]。研究發現在胃癌高發區的優勢基因型組合為cagA+,vacAs1/m1b/m2,iceA1/iceA2[20]。國內關于iceA基因的研究也有一些報道[2122],認為iceA1亞型菌株與重度炎癥特別是腺體萎縮和腸上皮化生關系密切。
4 新近發現的毒力基因
生物芯片技術運用于Hp的研究,描繪出了不同Hp之間的基因多態性差異,提供了Hp與人類共同進化的證據。Hp誘導宿主細胞反應的基因表達譜,為Hp致病機制的研究提供了一個新的思路。與疾病相關基因及基因表達的檢出差異,結合基因突變的方法,相關基因編碼蛋白的功能被進一步闡明。一系列新的Hp致病基因也逐漸被發掘出來,其中以編碼外膜蛋白的oipA基因、編碼黏附素的sabA,babA基因。編碼限制性核酸內切酶的hrgA基因和另一Hp基因位點JHP0947比較有代表性,它們與十二指腸潰瘍和/或胃癌的相關性,顯示它們有可能成為新的分子流行病學標志。
4.1 oipA(outer inflammatory protein )基因 oipA基因編碼前炎癥外膜蛋白,相對分子質量為34 kD,oipA是一種較強的Hp致病基因,特別在Hp感染的炎癥過程中起著重要的作用。oipA的基因狀態由信號肽編碼區CT雙核苷酸重復數目決定,基因的狀態決定其是否表達蛋白。Zambon等研究表明,oipA和cagA都與活動性胃炎、消化性潰瘍、胃癌有明顯的相關性[23]。對炎性因子抗體及Hp外膜蛋白家族成員的分析后,發現OipA與Hp感染后的臨床癥狀、細菌的定植密度、嚴重的中性粒細胞浸潤及較高濃度的黏膜IL8水平密切相關。對信號傳導通路的研究發現,oipA和cagA對于完整的IL8啟動子的激活都是必要的,但是要通過不同的途徑,在IRF1的上游產生分歧,cagA不涉及到STAT1IRF1ISRE途徑[24]。也許是基于此點,cagA和oipA對于IL8的分泌都有影響,但是oipA對于IL8具有更重要的作用。
4.2 babA(blood adhesion binding antigen)基因 babA編碼的蛋白質在胃上皮細胞表面與Leb血型抗原結合,有2個基因型:babA1和babA2,二者的序列高度同源,區別只是babA2在信號肽區存在10 bp的插入序列,形成轉錄的起始密碼子。缺失實驗證明,只有babA2具有功能活性,BabA1不具有與Leb結合的功能。Hp對胃黏膜上皮的黏附作用在其相關炎癥反應的起始中起關鍵作用。Hp黏附于胃黏膜上皮后,通過直接分泌毒素和間接誘導免疫反應而導致上皮損傷,這種黏附特性使Hp免于被胃蠕動、胃排空等力量排出體外,是Hp定居、生存及致病的必要條件。Hp黏附素較多,但目前已經證實的只有4種,即Leb結合黏附素babA、alpA、alpB和hopZ。其中babA是迄今為止惟一明確受體的Hp黏附素,Hp的babA2(Leb黏附素)編碼的細菌黏附素,增強了菌體與胃上皮細胞之間的作用,增強了Hp的致病性。有研究顯示babA2+以及cagA+/vacAs1/babA2+菌株(“三陽菌株”)與DU(Duodenal ulcer)、胃腺癌和胃癌前病變的發生顯著相關[25]。Zambon進一步研究發現,babA2與oipA、cagA等基因之間具有很強的關聯性,oipA及cagA的開放狀態與babA2具有協同作用,這幾個基因的共表達引起的感染具有高度腸化生的危險性[26]。近年來的研究認為表達babA的Hp與嚴重的胃黏膜損傷,高密度的Hp定植和嚴重的臨床后果密切相關[2728]。
4.3 hrgA基因 Ando等進行Hp染色體DNA對Mbol酶消化作用的敏感性研究中發現并鑒定了一個新的菌株特異性基因——hrgA基因,即限制性內切酶置換基因[29]。hrgA基因與cj1602基因同源,全長594 bp,但功能未知。在西方國家,hrgA陽性率比亞洲高,在亞洲(主要是韓國和日本)hrgA陽性率在胃癌患者比在非胃癌患者中高。并且hrgA陽性菌株在與AGS人類胃癌上皮細胞共同培養時能夠誘導IL8的分泌。劉慶春等首次完成了國內胃癌患者hrgA基因的檢測,發現hrgA陽性率在cagA陽性菌株比cagA陰性菌株高,且胃癌患者比對照的消化性潰瘍患者hrgA陽性率高[30]。
4.4 Hp的可塑區基因 隨著比較基因組學和功能基因組研究的開展,人們正開始將尋找Hp致病特異基因(尤其是與致癌相關的基因)的目標投向其“可塑區”(plasticity region)。Hp的可塑區基因,約占基因組3~4 %。Hp的可塑區基因最早是在比較J99與26695兩株細菌基因序列時被發現,J99有45 kb、26695有68 kb的基因G+C含量低,且具有菌株特異性,即為可塑區基因。研究人員推測與胃癌發生有關的基因位于該區。J99的可塑區含38個ORFs,即JHP914951。其中JHP947被認為是目前新發現的Hp致病標志,經流行病學調查發現其與cagPAI有顯著的相關性,且與臨床上的胃潰瘍,胃癌有關。
Occhialini等對43株Hp(17 株分離自胃癌,26 株分離自胃炎)進行檢測,發現JHP947在分離自胃癌比分離自胃炎標本的Hp有更高檢出率(64.7%~34.7%)[31]。隨后Santos對200株細菌(68 株自胃炎、53 株自潰瘍、79 株自胃癌)進行檢測,發現JHP947在分離自胃炎、潰瘍和胃癌的Hp中檢出率分別為44.1%、79.2%、86.1%,因而認為JHP947與潰瘍和胃癌的發生有關。而JHP940僅在幾株胃癌標本中檢出,因而認為JHP940只與胃癌的發生有關[27]。佘菲菲等從胃黏膜活檢組織中分離培養Hp,PCR擴增分離菌株的JHP940、JHP947和JHP949基因,分析這3個基因與胃及十二指腸疾病的關系,得出JHP947與胃癌和消化性潰瘍的發生密切相關[28]。目前對JHP947、JHP940基因的了解僅限于流行病學調查,它們與胃及十二指腸疾病的關系和致病機理仍不明,對可塑區基因的研究在進一步進行中。
目前世界各地開展了大量關于Hp基因多態性與胃癌發生的研究,然而尚未有哪個毒力基因或其亞型作為明確的胃癌危險因素被證實,且不同的研究報道的結果并不完全一致,許多問題存在爭議,對這些致癌基因的作用機制及其與胃癌的關系有待進一步研究。胃癌的發生是一個多病因多階段的過程,Hp作為胃癌的I類致癌因子,其致癌機理是一個多因素、多階段、多基因變異參與的過程,除了考慮為地區人種遺傳基因的變異及環境因素的不同外,還應考慮不同地區幽門螺桿菌感染率及基因亞型分布的差異為可能因素。有關Hp毒力基因及其致惡變方面研究進展很快,基礎研究方面的突破特別是對可塑區的研究技術上的突破將大大推動臨床根除Hp及Hp相關性胃腺癌和胃MALT淋巴瘤的預防及治療。
作者:林妙端 佘菲菲《福州大學學報》
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