1材料和方法
1.1材料限制性核酸內切酶,T4DNAligase購自New England Biolab公司. 厭氧發生劑、腦心浸液(干粉)購自生物梅里埃公司(bioMerieux). 其他試劑為國產分析純. 艱難梭菌(clostridium difficile, C.d VPI10463)從蘭州生物制品研究所購買. 大腸桿菌菌株BL21(DE3)及質粒PET22b(+)系南方醫科大學消化研究所存.
1.2方法
1.2.1目的基因的獲得C.d VPI 10463接種于腦心浸液(BHI)培養基中,37℃厭氧環境中透析培養72 h. 堿裂解法提取C.d基因組DNA. 參考Gene bank收錄的C.d VPI 10463基因序列,設計引物如:sense: 5′TCCGAATTCG CTTATGTCAACTAGTGAA3′ EcoRI, antisense: 5′GCACTCGAGTTCACTAATCACTAATTG3′, XhoI. 反應條件:50 μL反應體系,熱啟動法,94℃變性45 s, 60℃退火60 s, 72℃延伸150 s, 39個循環后再延伸10 min. 10 g/L糖凝膠電泳觀察擴增結果.
1.2.2重組質粒的構建與鑒定將酶切、純化的目的基因、質粒PET22b(+)按10∶1(摩爾數) 在T4DNAligase作用下16℃連接12 h. 熱休克法轉化. 挑單個菌落,接種在選擇性LB液體培養基中,A600 nm值達0.6,提取重組質粒. 重組質粒的鑒定:用EcoRI與XhoI雙酶切鑒定;以重組質粒為模板,進行PCR反應,送上龙8娱乐官方网站亞公司測序.
1.2.3目的基因表達陽性克隆菌落接種到2 mL選擇性LB培養液37℃, 180 r搖菌致A600 nm為0.6,4℃過夜,然后2%轉接LB培養液中,培養3 h至A600 nm值為0.8,加IPTG至終濃度為1 mmol/L,誘導后取樣. 產物進行SDSPAGE分析.
2結果
2.1PCR擴增的目的基因電泳分析發現在1800 bp左右有一條帶,大小與預計相符(圖1).
圖1瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物 略
2.2重組質粒的鑒定將獲得重組質粒命名為PET22b(+)CDB3,電泳初步鑒定結果與預期相符(圖2). 直接以PET22b(+)CDB3為模板進行測序,得到的DNA序列,與Gene bank記錄的C.d VPI10463的ToxinB3基因序列的同源性為99%.
圖2目的基因的PCR產物、重組質粒和PET22b(+)載體用EcoRI單酶切的圖譜 略
2.3重組蛋白的誘導表達經IPTG誘導后,120 g/L SDS PAGE分析表明,含有PET22b(+)CDB3宿主菌表達出Mr約為71.3×103,與預期的蛋白大小相符,含質粒pET 22b(+)及無質粒的細菌則無此特異條帶. 在A600 nm值為0.8,IPTG終濃度為1 mmol/L,誘導4 h時,重組蛋白的表達量最大,以可溶性蛋白為主,便于純化. 凝膠自動掃描分析,其PET22b(+)CDB3重組蛋白占細菌周質總蛋白的34%,可溶性表達占上清的22.7%,包涵體占沉淀的25.7% (圖3).
圖3CDB3基因誘導表達產物的SDSPAGE分析 略
3討論
C.d是腸道感染中僅次于彎曲桿菌的常見致病菌,產生的毒素A與毒素B對人體造成危害,被公認為發達國家中最重要的院內感染源之一[1]. 雖然口服甲硝唑或萬古霉素治療可取得較好的療效,但目前已存在耐藥及停藥后復發等問題. 疫苗接種可使高危人群獲得持久和較強的免疫力,是預防與控制感染的有效措施[2]. C.d重組抗原的研究已見較多的報道,但多數是集中在毒素A上[3],而對毒素B的研究則相對較少. Genth等[4]的研究將毒素B分成3個氨基酸片段:CDB1(氨基酸1546),CDB2(氨基酸 9011750),CDB3(氨基酸17512366),發現抗毒素B抗體與CDB3可以發生強烈反應,抗C.d抗體既與CDB1又能與CDB3 反應,CDB2則與兩抗體均不反應. 說明CDB3是良好的抗原. 進一步實驗發現,只有抗CDB3抗體才能保護完整細胞免受毒素B的細胞毒性,而抗CDB1抗體只有進入細胞內才能起保護作用 . 說明該段很有可能成為制備疫苗和診斷抗原的重要候選蛋白. 故選取了毒素B羧基末端CDB3 (氨基酸17512366)進行表達,為以后的疫苗和抗原鑒定的研究建立基礎.
本研究參考C.d國際標準株VPI 10463基因序列,用自行設計的CDB3引物在PCR反應中表現出較高的特異性,為理想的引物序列. 在上、下游引物中分別加入EcoRI與XhoI酶切位點,保證了讀碼方向的正確性. 為便于下一步的表達和純化工作又將其裝入了末端帶有His標簽的融合表達載體,酶切鑒定和測序結果顯示獲得了帶有特異的CDB3基因. 蛋白電泳分析表明獲得了高效表達的C.d ToxinB3克隆株,本實驗所表達的蛋白,與該基因編碼的蛋白的分子質量大小是一致的,更進一步驗證了克隆的目的基因的正確性. 因此,本研究為研制C.d重組疫苗及制備診斷試劑 奠定了一定的基礎.
作者:劉紅升,張清華,姜泊,蔣知新《中國生物制品學雜志》
【參考文獻】 (略)
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