摘要　目的:研究福氏志賀菌對諾氟沙星的耐藥性及耐藥機制。方法:收集福氏志賀菌30株，進行抗菌藥物敏感試驗，4株耐藥菌，1株敏感菌和福氏志賀菌標準菌51573的gyrA基因的N末端編碼區進行PCR擴增并克隆和測序。結果:福氏志賀菌對諾氟沙星的耐藥率高達53.3%，gyrA基因的序列分析結果揭示存在3個導致氨基酸改變的基因點突變：絲氨酸-83→亮氨酸，天冬氨酸-87→天冬酰氨，天冬氨酸-87→甘氨酸。結論:福氏志賀菌對諾氟沙星已有較高的耐藥性，gyrA基因點突變與福氏志賀菌對諾氟沙星的耐藥性有關。

　　　關鍵詞:志賀菌屬　諾氟沙星　gyr A基因

　　80年代開始諾氟沙星作為新一代的氟喹諾酮類抗菌藥物，對氨芐西林等耐藥的多重耐藥志賀菌表現出強大的殺菌活力，志賀菌的藥物敏感率在95%以上^［1，2］。為了解福氏志賀菌對諾氟沙星的耐藥性和耐藥機制，龙8娱乐官方网站收集了30株福氏志賀菌進行抗菌藥物敏感試驗，對其中4株耐藥菌、1株敏感菌和福氏志賀菌標準菌51573的gyr A基因的N末端編碼區進行了聚合酶鏈反應(PCR)擴增并克隆和序列分析以檢測gyr A基因突變。

　　材料和方法

　　一、菌株的收集

　　30株福氏志賀菌于1996年8月在浙江省余杭市第一醫院從臨床糞便培養標本中分離所得，均經過常規生化和血清學鑒定。隨機對其中4株耐藥菌、1株敏感菌和福氏志賀菌標準菌51573進行分子生物學研究，志賀菌屬診斷血清購自衛生部蘭州生物制品研究所。福氏志賀菌標準菌51573購自中國藥品生物制品檢定所。

　　二、抗菌藥物敏感試驗

　　紙片法采用Kirby-Bauer法，最低藥物抑菌濃度(MIC)測定采用平皿雙倍稀釋法。諾氟沙星藥敏紙片購自浙江省軍區后勤部衛生防疫檢驗所。諾氟沙星標準品由浙江新昌制藥廠提供，批號：920807，效價99%。質控菌為大腸埃希菌ATCC25922。

　　三、PCR擴增gyr A基因N末端區

　　由于志賀菌在遺傳學上與大腸埃希菌相近，因此龙8娱乐官方网站根據大腸埃希菌DNA旋轉酶(Gyrase)基因序列設計引物^［3］。PCR擴增片段位于gyr A基因24～671位點，PCR擴增產物為648bp。引物Ⅰ：5′-TACACCGGTCAACATTGAGG-3′，引物Ⅱ：5′-TTAATGATTGCCGCCGTCGG-3′。染色體DNA的提取見參考文獻［4］。100μl PCR混合液包括：10×PCR緩沖液10μl，25mmol/L MgCl₂ 7μl,20mmol/L dNTP 0.5μl,引物Ⅰ 100ng，引物Ⅱ100ng，Taq酶2.5u，模板DNA 50ng,加dH₂O至100μl。PCR條件：94°C預變性5分鐘。94°C 1分鐘，56°C 45秒，72°C 30秒，共35個循環。反應結束后72°C延伸10分鐘。PCR重復進行2次，PCR所用引物及試劑均購自美國Promega公司。PCR儀為美國Perkin Elmer公司的PE480熱循環儀。

　　四、PCR產物克隆

　　使用美國Promega公司的pGEM-T Easy Vector SystemsⅠ進行PCR擴增產物的克隆。連接反應包括：??T4 DNA ligase 10×Buffer 1μl,pGEM-T Easy vector 1μl(50ng),PCR 產物 2μl(30ng),T4 DNA Ligase 1μl(3u),dH₂O 5μl,4°C過夜。感受態細胞為大腸埃希菌DH5α。將轉化細胞培養液均勻涂布在含有氨芐西林(50μg/ml)的麥康凱平板上，根據α-互補現象，37°C過夜后挑取白色單個菌落于LB液體培養基增菌后用堿法抽提質粒。EcoRI單酶切進行重組子的鑒定，轉化試驗及其他操作過程參見美國冷泉港實驗室出版的《分子克隆實驗指南》^［5］。

　　五、gyr A基因序列測定和分析

　　按照Sanger雙脫氧鏈末端終止法，使用美國Promega公司的Taq Track Sequencing Core System kit進行測序反應，詳細過程參見使用手冊，測序反應和電泳重復2次。手動測序儀為美國生命技術公司生產的GiBcoBRL sequencing Model S2 DNA測序儀，放射性同位素采用α-³²P dATP，購自北京亞輝生物醫學工程公司。

　　結果

　　一、生化與血清學鑒定

　　共分離志賀菌30株，均為福氏志賀菌，未見其他血清型。

　　二、抗菌藥物敏感試驗結果

　　30株福氏志賀菌中有16株對諾氟沙星耐藥，耐藥率達53.3%，對諾氟沙星的MIC范圍為0.25～128mg/L,MIC₅₀為32mg/L，MIC₉₀為32mg/L，用于gyr A基因測定的5株福氏志賀菌的MIC依次為32、64、32、32、0.25mg/L。紙片法與MIC的結果相符。

　　三、PCR反應產物的電泳結果

　　見圖1。

M：1kb分子量標準，1～4：耐藥菌，5：敏感菌，6：福氏志賀菌標準菌51573，C：空白對照圖1　0.7%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色

　　四、gyr A基因序列的聚丙烯酰胺凝膠電泳同位素放射性自顯影結果

　　見圖2。gyr A基因序列及相關氨基酸的結果見表1。敏感菌和標準菌的gyrA基因序列與國外報道的序列完全相同^［6］，與大腸埃希菌在氨基酸位點85及89上存在堿基變異但不引起氨基酸改變。

　　討論

　　諾氟沙星作為治療細菌性痢疾的藥物在初期取得了很好的療效，但隨著這類藥物使用的增多其耐藥性逐漸上升。本研究中龙8娱乐官方网站在流行季節用不到1個月的時間里收集到的30株福氏志賀菌對諾氟沙星的耐藥率達到53.3%(16/30)。這數字較國內其它報道的結果相對較高^［7］，可能與龙8娱乐官方网站收集菌株偏少且過于集中有關，有待于擴大樣本數量更廣泛地進行流行病學的調查。細菌對氟喹諾酮類藥物產生耐藥機制主要為三方面：(1) Gyrase基因點突變；(2)膜通透性下降；(3)主動流出系統。其中gyr A基因發生點突變是造成細菌產生耐藥性的主要原因^［8］。國外對氟喹諾酮類藥物耐藥機制已有較多的研究，其中對gyr A基因點突變的研究最引人關注，研究已經發現gyr A基因突變的位點集中發生在N末端核苷酸序列為199至318的一個小區間內，此區間已被公認為氟喹諾酮類藥物耐藥決定區^［9］，并已發現在編碼氨基酸67、81、83、87、106等位點上的染色體DNA上出現導致氨基酸改變的堿基點突變。但這些研究大多集中于大腸埃希菌以及金黃色葡萄球菌等，對志賀菌的研究甚少。Horiuchi等^［10］在7株對氟喹諾酮類藥物敏感性下降的宋內志賀菌的研究中發現同位素¹⁴C標記的氧氟沙星在這些細菌內的蓄積與敏感菌相同，氧氟沙星對這些細菌DNA的合成抑制作用甚少，并通過體外DNA旋轉酶活性的研究推測這些細菌對氟喹諾酮類藥物敏感性下降是由于gyr A基因突變造成的。Rahman等^［6］發現痢疾志賀菌Ⅰ型對萘啶酸耐藥是由于gyr A基因氨基酸83位點上C→T堿基突變導致絲氨酸突變為亮氨酸造成的。迄今為止，國內外關于福氏志賀菌對氟喹諾酮類藥物耐藥機制的研究，目前作者尚未見有報道。

　　龙8娱乐官方网站通過對gyr A基因序列的對比研究中首次發現在耐藥福氏志賀菌gyr A基因的83、87氨基酸位點上存在著導致氨基酸改變的基因點突變。因此，龙8娱乐官方网站認為這些臨床分離的福氏志賀菌對諾氟沙星產生耐藥性與gyr A基因的點突變有關，在這些耐藥菌中是否存在細菌膜對藥物的通透性下降或主動流出系統尚待進一步的研究。

　　作者單位：310003　杭州，浙江醫科大學附屬第一醫院(丁建強、吳仲文、馬亦林、龔正、陳亞崗)；浙江省余杭市第一醫院(王建華)

　　參考文獻

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　　10　Horiuchi S, Inagaki Y, Yamamoto N, et al. Reduced susceptibilities of shigella sonnei strains isolated from patients with dysentery to fluoroquinolones. J Antimicrob Chemother, 1993, 37: 2486-2489.

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